郭　凱,燕志強(qiáng),金　輝,李秀壯,何小鳳,楊曉燕,秦　波*

(1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;2 中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000)

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肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣生長(zhǎng)的化感作用及其機(jī)理研究

郭凱1,2,燕志強(qiáng)2,金輝2,李秀壯2,何小鳳2,楊曉燕2,秦波2*

(1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;2 中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000)

摘要:該研究以萵苣為受體植物,分析了酚酸類化感物質(zhì)肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣幼苗生長(zhǎng)的活性效應(yīng)及其作用機(jī)理,以揭示酚酸類化合物的化感作用機(jī)制。結(jié)果顯示:(1)不同濃度的肉桂酸均對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及鮮重產(chǎn)生明顯的抑制作用,當(dāng)肉桂酸的濃度為1 000 μmol/L時(shí)其對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及鮮重的抑制率分別達(dá)到了89%、74%和49%;咖啡酸對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均表現(xiàn)出低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)促進(jìn)、高濃度(100和1 000 μmol/L)抑制的活性作用模式,且高濃度下肉桂酸對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于咖啡酸。(2)較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣根尖細(xì)胞活力均無明顯影響;高濃度(100和1 000 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸使萵苣根尖細(xì)胞的死亡數(shù)明顯增加。(3)低濃度(0.1和1.0 μmol/L)的肉桂酸和較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的咖啡酸對(duì)萵苣根部的活性氧積累均無明顯影響;當(dāng)肉桂酸處理濃度大于10 μmol/L及咖啡酸處理濃度大于100 μmol/L時(shí),隨著濃度的升高萵苣根部活性氧的積累大量增加。研究表明,一定濃度的肉桂酸和咖啡酸均能夠誘導(dǎo)萵苣體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和積累,并降低幼苗根尖細(xì)胞的活力,進(jìn)而影響萵苣幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育,且肉桂酸的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于咖啡酸。

關(guān)鍵詞:肉桂酸;咖啡酸;萵苣;化感效應(yīng);作用機(jī)理

Molisch于1937年首次提出了植物化感作用的概念,認(rèn)為是所有植物(含微生物)之間的相互作用[1]。Rice在1984年將其較完善地定義為環(huán)境中一種植物(含微生物)直接或者間接地通過化學(xué)物質(zhì)的釋放對(duì)另一種植物(含微生物)產(chǎn)生有利或者不利影響的現(xiàn)象[2]?；凶饔脧V泛存在于自然界中,與生態(tài)系統(tǒng)中的生物入侵以及農(nóng)業(yè)中的連作障礙等現(xiàn)象密切相關(guān)[3-4]。植物化感物質(zhì)是植物體內(nèi)次生代謝的產(chǎn)物,自然狀況下主要通過體外釋放揮發(fā)物質(zhì)、表面淋溶、根部分泌和殘?bào)w分解等4種途徑進(jìn)入環(huán)境[3]?；形镔|(zhì)能夠?qū)κ荏w植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面產(chǎn)生有利或不利的影響,對(duì)化感物質(zhì)活性作用機(jī)理的解釋是植物化感研究中最主要的難點(diǎn)之一[5-6]。

酚酸通常為芳香環(huán)上帶有活性羧基的有機(jī)酸,是引起植物自毒作用的主要原因[7]。酚酸類化感物質(zhì)普遍存在于高等植物體內(nèi)及其土壤中,主要通過根系的分泌作用釋放到環(huán)境中,進(jìn)而抑制周圍其他植物的生長(zhǎng)[8-10]。肉桂酸和咖啡酸是兩種常見的酚酸類化感物質(zhì)。肉桂酸是茄子根系分泌物中主要的化感物質(zhì)之一[11],能夠抑制過氧化物酶的活性并誘導(dǎo)類脂的過氧化[12],對(duì)黃瓜[13]、大豆[14]、辣椒[15]等多種植物的種子萌發(fā)及生長(zhǎng)也產(chǎn)生影響?？Х人崮軌蛞种屏姿峄?、蛋白酶等多種酶的活性,對(duì)多種植物的萌發(fā)和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[16-18]。前人對(duì)肉桂酸和咖啡酸這兩種酚酸的化感作用機(jī)制有報(bào)道[13,18],但對(duì)于不同結(jié)構(gòu)酚酸類化合物化感作用效果差異的原因缺少相應(yīng)的研究和佐證。本研究以化感作用較為敏感的萵苣為受體植物,在明確肉桂酸和咖啡酸活性作用效果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了2種酚酸類化合物對(duì)植物細(xì)胞活力以及活性氧的影響,并比較和分析了2種酚酸類化合物產(chǎn)生的化感作用效果的差異,為揭示肉桂酸和咖啡酸介導(dǎo)的化感作用及連作障礙機(jī)制提供參考。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

萵苣品種為‘四季白尖葉’,種子購(gòu)于四川種都種業(yè)有限公司。肉桂酸(反式為主)和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,純度95%。

1.2材料培養(yǎng)與處理

肉桂酸和咖啡酸的標(biāo)準(zhǔn)品分別用DMSO溶解配制成100 mmol/L的母液,并用蒸餾水稀釋100倍得到最高試驗(yàn)濃度為1 000 μmol/L的溶液,然后將此溶液依次稀釋10倍,得到最終處理濃度分別為1 000、100、10、1.0和0.1 μmol/L的5種處理溶液,分別取1 mL各種濃度的處理溶液置于鋪有濾紙的六孔板中。將萵苣種子放在培養(yǎng)皿中的濕潤(rùn)濾紙上,并置于恒溫恒濕的培養(yǎng)箱(瑞華,HP150HS)中,25 ℃黑暗條件下萌發(fā)24 h后,選取生長(zhǎng)一致的萵苣幼苗轉(zhuǎn)移到上述六孔板的濾紙上,以含有相同DMSO含量的水溶液為對(duì)照,每個(gè)處理至少6株幼苗,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的觀察和測(cè)定。

1.3測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量肉桂酸和咖啡酸處理48 h后用毫米刻度尺測(cè)量幼苗的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng),用分析天平(Mettler-Toledo,AL104)測(cè)量幼苗鮮重。其中抑制率的計(jì)算公式為:

抑制率=(對(duì)照組數(shù)據(jù)-處理組數(shù)據(jù))/對(duì)照組數(shù)據(jù)×100%

1.3.2細(xì)胞活力觀察細(xì)胞活力觀察參照Koodkaew等[19]的方法。切取約0.5 cm的萵苣幼苗根尖,放入含有12.5 μg/mL二乙酸熒光素(FDA)和5 μg/mL碘化丙啶(PI)的染液中,避光著色10 min,蒸餾水沖洗干凈后置于載玻片上,在熒光顯微鏡(Leica,DMI4000B)下用450～490 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光下觀察并拍照。

1.3.3活性氧觀察活性氧觀察參考Garnczarska[20]的方法。室溫下萵苣幼苗的根在二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)染色液(含10 mmol/L DHE,0.01%丙酮和100 mmol/L CaCl2,pH=4.75)中避光染色5 min,然后在100 mmol/L CaCl2中震蕩清洗10 min以去除多余的染料,在熒光顯微鏡(Leica,DMI4000B)下用450～490 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光下觀察并拍照。

1.4數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0進(jìn)行差異顯著性分析,用Photoshop 7.0進(jìn)行圖片處理。

2結(jié)果與分析

2.1肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣幼苗生長(zhǎng)的影響

不同濃度肉桂酸對(duì)受體植物萵苣幼苗的根、莖的伸長(zhǎng)和鮮重均表現(xiàn)出抑制作用,且抑制作用隨處理濃度的升高而增強(qiáng)(表1)。其中,萵苣幼苗根長(zhǎng)在較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的處理下比對(duì)照顯著減少了10%～14%,而在100和1 000 μmol/L濃度下的抑制率分別達(dá)到了24%和89%,在1 000 μmol/L下幼苗主根的生長(zhǎng)幾乎完全受到抑制;萵苣幼苗莖的生長(zhǎng)在肉桂酸處理濃度達(dá)到1.0 μmol/L時(shí)開始受到顯著性抑制,且抑制作用隨處理濃度的升高而增強(qiáng),當(dāng)濃度升高到1 000 μmol/L時(shí)已受到強(qiáng)烈的抑制(抑制率為74%);鮮重指標(biāo)反映了幼苗整體生長(zhǎng)水平,萵苣幼苗鮮重在 0.1 μmol/L的肉桂酸處理下已受到顯著性抑制,且隨著處理濃度的升高抑制效果更加顯著,鮮重的抑制率在濃度為1 000 μmol/L時(shí)已達(dá)到48%;隨著肉桂酸處理濃度(0.1、1、10和100 μmol/L)的升高,根長(zhǎng)/莖長(zhǎng)的數(shù)值隨之增大,表明相對(duì)于根長(zhǎng)肉桂酸對(duì)萵苣幼苗莖長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng),當(dāng)濃度升高到1 000 μmol/L時(shí)肉桂酸對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用顯著強(qiáng)于莖長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,肉桂酸通過對(duì)幼苗根、莖的伸長(zhǎng)以及鮮重的抑制來影響萵苣幼苗的整體生長(zhǎng)狀況,且在低濃度下就產(chǎn)生顯著的抑制作用,并存在劑量效應(yīng)。

同時(shí),咖啡酸對(duì)受體植物萵苣幼苗的根、莖的伸長(zhǎng)均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用模式(表2)。其中,萵苣幼苗的主根長(zhǎng)在咖啡酸的濃度為0.1和1.0 μmol/L時(shí)比對(duì)照(0 μmol/L)有一定的增加,并在10 μmol/L時(shí)達(dá)到顯著水平;而在高濃度(100和1 000 μmol/L)咖啡酸處理下主根長(zhǎng)受到顯著抑制,抑制率分別為12%和25%。與主根生長(zhǎng)的作用效果不同,萵苣莖的生長(zhǎng)在 0.1 μmol/L的咖啡酸處理下就受到顯著促進(jìn),當(dāng)濃度為1.0和10 μmol/L時(shí)雖仍受到一定促進(jìn),但未達(dá)到顯著性水平;在高濃度(100和1 000 μmol/L)咖啡酸處理下,莖長(zhǎng)受到顯著抑制,抑制率分別為30%和41%。萵苣幼苗的鮮重在0.1、1.0和10 μmol/L的咖啡酸處理下與對(duì)照并無顯著性差異,僅在高濃度(100和1 000 μmol/L)時(shí)受到顯著性抑制,抑制率分別為15%和29%(表2);根長(zhǎng)/莖長(zhǎng)的數(shù)據(jù)表明較低處理濃度(0.1、1和10 μmol/L)下的咖啡酸對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的促進(jìn)作用效果相比對(duì)照無顯著差異,高濃度(100和1 000 μmol/L)下咖啡酸對(duì)莖長(zhǎng)的抑制作用顯著強(qiáng)于根長(zhǎng)?？梢?咖啡酸主要是通過促進(jìn)或抑制萵苣幼苗根、莖的伸長(zhǎng)來影響其整體生長(zhǎng)情況,且高濃度咖啡酸對(duì)幼苗莖長(zhǎng)的抑制要明顯強(qiáng)于對(duì)根長(zhǎng)的抑制。

表1　肉桂酸對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和鮮重的化感作用

注:表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差;同指標(biāo)內(nèi)不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異;下同。

Note:The data listed in the table as mean±SD;Different normal letters in the same characters indicated significant differences among treatments at 0.05 level;The same as below.

表2　咖啡酸對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和鮮重的化感作用

通過比較可以發(fā)現(xiàn),肉桂酸在各種濃度下均對(duì)萵苣幼苗根、莖的伸長(zhǎng)以及鮮重產(chǎn)生抑制作用,咖啡酸對(duì)幼苗根、莖的伸長(zhǎng)則表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的效果;高濃度(100和1 000 μmol/L)處理下,肉桂酸對(duì)萵苣幼苗根、莖的伸長(zhǎng)以及鮮重的抑制作用明顯強(qiáng)于咖啡酸。

2.2肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣根尖細(xì)胞活力的影響

逆境條件會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)相關(guān)的酶失活或變性,嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成細(xì)胞和組織的死亡。因此植物細(xì)胞活力的檢測(cè)是判定植物受傷害程度的直接和有效的方法[21]。本實(shí)驗(yàn)采用熒光染料染色的方法分別檢測(cè)了不同濃度肉桂酸和咖啡酸處理下萵苣根尖細(xì)胞活力的變化情況。利用PI能使死細(xì)胞著色及FDA能使活細(xì)胞著色的特性,可以用熒光顯微鏡觀察FDA/PI雙染色后植物根尖的細(xì)胞活力[19]。結(jié)果(圖版Ⅰ,1～12)顯示,處理2 d后,較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的肉桂酸(圖版Ⅰ,1～4)和咖啡酸(圖版Ⅰ,7～10)對(duì)萵苣根尖細(xì)胞活力無明顯影響,染色結(jié)果與對(duì)照基本一致;當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí),受體根尖細(xì)胞的死亡數(shù)均明顯增加(圖版Ⅰ,5、11);而在最高試驗(yàn)濃度1 000 μmol/L下,肉桂酸和咖啡酸均使大部分的根尖細(xì)胞失去活力,同時(shí)可以看出肉桂酸使幼苗根部膨大變形(圖版Ⅰ,6、12)。以上結(jié)果說明一定濃度的肉桂酸和咖啡酸均能夠使萵苣根尖細(xì)胞的死亡數(shù)增加,顯著降低萵苣根尖細(xì)胞活力。

2.3肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣根部活性氧的影響

3討論

隨著現(xiàn)代生物學(xué)理論技術(shù)和分離分析技術(shù)的快速發(fā)展,化感作用已成為解決農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及生態(tài)平衡等方面的研究熱點(diǎn)[25]。酚酸類化合物是一類重要的化感物質(zhì),廣泛地存在于植物體內(nèi)和耕種土壤中。酚酸類物質(zhì)在土壤中積累是引起作物連作障礙的主要原因,對(duì)次年作物生長(zhǎng)和土壤活性具有破壞性的影響,具有重要的研究意義[26-27]。

本試驗(yàn)以兩種酚酸類化感物質(zhì)肉桂酸和咖啡酸為研究對(duì)象,以蔬菜類植物萵苣為受體,采用植物生理學(xué)的方法,系統(tǒng)研究了肉桂酸和咖啡酸對(duì)萵苣幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)以及對(duì)萵苣根部細(xì)胞活力和活性氧方面的影響,并比較和分析了2種酚酸類化合物作用效果的差異。結(jié)果顯示,不同濃度下的肉桂酸均對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)產(chǎn)生明顯的抑制作用;咖啡酸對(duì)萵苣幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均表現(xiàn)出低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)促進(jìn)、高濃度(100和1 000 μmol/L)抑制的活性作用模式,且高濃度下肉桂酸對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于咖啡酸。

本研究有關(guān)細(xì)胞活性和活性氧累積的觀察結(jié)果表明,在較高濃度(100和1 000 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸作用下,萵苣根尖端大部分細(xì)胞失去活力。低濃度(0.1和1.0 μmol/L)的肉桂酸和較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的咖啡酸對(duì)萵苣根部的活性氧積累均無明顯影響;當(dāng)肉桂酸處理濃度大于10 μmol/L及咖啡酸處理濃度大于100 μmol/L時(shí),隨著濃度的增大萵苣根部活性氧的積累大量增多。據(jù)此可以初步推測(cè)萵苣幼苗在兩種酚酸類化感物質(zhì)的脅迫作用下會(huì)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和積累,而活性氧的積累會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞以及細(xì)胞活力的下降,最終影響受體植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

本研究通過對(duì)肉桂酸和咖啡酸化感作用機(jī)理的探索,初步闡釋了酚酸類物質(zhì)對(duì)受體植物化感作用的植物生理學(xué)機(jī)理,并分析了不同結(jié)構(gòu)酚酸類物質(zhì)作用效果差異的原因,可為進(jìn)一步揭示酚酸類物質(zhì)化感作用以及作物連作障礙機(jī)理提供方法和依據(jù)。

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圖版 ⅠFDA和PI雙染色后肉桂酸和咖啡酸處理萵苣根尖細(xì)胞活力觀察

根尖的灰色部位代表失去活力的細(xì)胞;1～6.肉桂酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L;7～12.咖啡酸處理濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L。

Plate ⅠCell viability of lettuce root tips treated by cinnamic acid and caffeic acid after dyeing with FDA and PI

The gray zone of root tips represented cells without viability;Fig.1-6.The concentrations of cinnamic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.Fig.7-12.The concentrations of caffeic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.

圖版 ⅡDHE染色后肉桂酸和咖啡酸處理萵苣根部活性氧積累觀察

根部的橘紅色部位代表積累活性氧的細(xì)胞;1～6.肉桂酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L;7～12.咖啡酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L。

Plate ⅡEffects of cinnamic acid and caffeic acid on ROS production in lettuce roots dyeing with DHE

The orange red zone of roots represented cells that accumulating ROS;Fig.1-6.The concentrations of cinnamic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively;Fig.7-12.The concentrations of caffeic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Allelopathic Effect and Mechanism of Cinnamic Acid and Caffeic Acid on the Growth of Lettuce

GUO Kai1,2,YAN Zhiqiang2,JIN Hui2,LI Xiuzhuang2,

HE Xiaofeng2,YANG Xiaoyan2,QIN Bo2*

(1 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;2 Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Abstract:In this paper,we investigated the allelopathic effects of cinnamic acid and caffeic acid and their phytotoxic mechanism on lettuce seedlings,in order to reveal the mechanism of allelopathy by phenolic acids.The results showed that:(1)root length,shoot length and fresh weight of lettuce seedlings were all obviously inhibited by cinnamic acid at different concentrations,and the inhibition rate of root length,shoot length and fresh weight at concentration of 1 000 μmol/L was 89%,74% and 49%,respectively.Root length and shoot length of lettuce seedlings both were promoted at low concentration (0.1,1.0 and 10 μmol/L) and inhibited at high concentration (100 and 1 000 μmol/L) by caffeic acid.Besides,the growth inhibition of cinnamic acid on lettuce seedlings was obviously stronger than that of caffeic acid at high concentration.(2)Cinnamic acid and caffeic acid both had no significant effect on cell viability in lettuce root tips at low concentration (0.1,1.0 and 10 μmol/L).High concentration (100 and 1 000 μmol/L) of cinnamic acid and caffeic acid both significantly increased the number of dead cells.(3)Low concentration of cinnamic acid (0.1 and 1.0 μmol/L) and caffeic acid (0.1,1.0 and 10 μmol/L) both had no significant effect on the accumulation of reactive oxygen species (ROS).When the concentration of cinnamic acid was over 10 μmol/L and the concentration of caffeic acid was over 100 μmol/L,the accumulation of ROS increased rapidly with the increasing of concentration.ROS was induced and accumulated in lettuce seedlings under the stress of cinnamic acid and caffeic acid,which leaded to the reduction of cell viability and finally affected the growth and development of lettuce seedlings.Furthermore,the inhibition effect of cinnamic acid was significantly stronger than that of caffeic acid.

Key words:cinnamic acid;caffeic acid;lettuce;allelopathic effect;mode of action

中圖分類號(hào):Q942.5;Q945.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:郭凱(1990-),男,碩士研究生,主要從事植物活性物質(zhì)的分離分析及作用機(jī)理研究。E-mail:guokaidts@163.com*通信作者:秦波,研究員,主要從事植物化學(xué)生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。E-mail:bqin@licp.cas.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31070386,21302195,31300290);中國(guó)科學(xué)院蘭州分院甘肅省院地合作項(xiàng)目;甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2015-25)

收稿日期:2015-08-11;修改稿收到日期:2015-10-07

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0093-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0093