陳立凱,盧蘇龍,劉永柱,王　慧,陳志強,郭　濤

(華南農業(yè)大學 國家植物航天育種工程技術研究中心,廣州 510642)

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水稻矮稈基因iga-1的序列變異和表達分析

陳立凱,盧蘇龍,劉永柱,王慧,陳志強,郭濤*

(華南農業(yè)大學 國家植物航天育種工程技術研究中心,廣州 510642)

摘要:該研究以水稻矮稈突變體cha-2為材料,對控制其表型性狀的iga-1基因進行候選基因篩選,利用基因注釋數據庫對定位區(qū)間進行候選基因預測,通過ORF及其上下游調控區(qū)域的測序、序列比對及關鍵元件分析進行序列變異研究,半定量PCR檢測目標基因的表達模式,明確其在基因序列、表達模式的變異,探討其分子遺傳調控機理。結果顯示:(1)在隱性核基因iga-1精細定位基礎上預測得到3個ORF,其中2個編碼dnaJ分子伴侶(含有dnaJ結構域的蛋白),分別是LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1個為已克隆的水稻矮稈基因RGA1(LOC_Os05g26890)。(2)ORF序列分析表明矮稈突變體cha-2與野生型僅在RGA1基因座存在SNP變異,但未造成氨基酸編碼的改變。(3)表達模式分析發(fā)現,矮稈突變體cha-2 的RGA1基因在種子萌發(fā)期、二葉期、四葉期和分蘗期等4個發(fā)育時期均不表達,且在‘中花11’、‘石狩白茅’的遺傳背景下穩(wěn)定遺傳,均顯現出失活狀態(tài),初步確定RGA1為iga-1的候選基因。(4)對RGA1基因上游和下游調控轉錄關鍵區(qū)進行測序結果表明,突變體cha-2存在865 bp的大片段缺失,包括第1外顯子、部分第1內含子和轉錄起始上游區(qū)域。研究推斷,突變體cha-2的矮稈基因iga-1正是沒有活性的RGA1基因,其轉錄關鍵區(qū)域的大片段缺失,導致無法正常轉錄表達。

關鍵詞:水稻;矮稈基因;缺失突變;G蛋白α亞基;iga-1

株高和分蘗是水稻株型結構中的兩個重要農藝性狀,也是影響產量的關鍵因素[1]。自然變異產生的半矮稈基因sd-1在水稻育種史上具有重要影響[2-3],利用sd-1系列矮源種質,中國在水稻矮化育種上取得重要進展,先后育成了大批高產、優(yōu)質、抗倒伏的優(yōu)良品種在生產上大面積應用。但是,單一矮源的廣泛利用存在遺傳脆弱性風險[4],限制了新品種生產潛力的進一步提高。

一般認為,水稻植株矮化是矮稈主基因表達作用的結果,同時也受到修飾基因或抑制基因的影響。矮稈基因能直接導致水稻植株形態(tài)學或細胞結構發(fā)生變化,如節(jié)間變短或細胞個數減少,從而使植株變矮[5]。迄今已登記的矮稈基因接近100多個,包括小粒矮稈(d1、d7、d11等)、畸形矮稈(d2、d6、d20等)、半矮稈(sd-1、sd-g、sd-t等)和多蘗矮稈(htd1、tdr1、tdr2等)[6]。多數新發(fā)現的矮稈突變體經常伴隨其他不良性狀,難以在生產上利用[7]。相對于自然突變,空間誘變是創(chuàng)新矮稈基因的潛在途徑。目前,已通過空間誘變技術創(chuàng)造了一系列矮稈突變體,其中部分突變體應用于育種實踐[8]。

本研究通過空間誘變獲得矮稈突變體cha-2,該突變體株高降低、粒型短圓、著粒密度高,并將控制矮稈性狀的突變基因iga-1精細定位于第5染色體約50 kb的范圍內[6,9],但尚未實現候選基因篩選。本研究在前期工作基礎上,通過序列檢測和表達分析鑒定候選基因。研究結果有望進一步豐富水稻矮化基因分子調控機制,為株型育種提供理論指導。

1材料和方法

1.1供試材料

‘特秈占13’為野生型原種,是廣東省佛山市農科所選育的秈型常規(guī)稻品種?！蓐栒渲樵纭癁楦叨捚贩N,是廣東省惠陽地區(qū)秈型常規(guī)稻。cha-2是由‘特秈占13’(TXZ13)干種子經衛(wèi)星搭載后,在地面種植誘變后代篩選得到的矮稈突變體,經多世代觀察,其矮稈性狀穩(wěn)定遺傳(圖1)。遺傳分析表明其攜帶2個矮稈基因,基因型為sd1sd1iga-1iga-1。以‘惠陽珍珠早’(HYZZZ)為輪回親本、cha-2為非輪回親本,回交3次將iga-1導入‘惠陽珍珠早’,形成矮稈材料cha-2n(圖1),矮稈基因型為SD-1SD-1iga-1iga-1。利用同樣方法,將iga-1分別導入‘中花11’(ZH11)、‘石狩白茅’(SSBM),形成ZH11-iga-1、SSBM-iga-1矮稈株系。

A.灌漿期葉片;B.谷粒;C.灌漿期稻穗;D.灌漿期植株;每個圖中從左到右依次為cha-2、cha-2n、特秈占13和矮腳南特

引物Primer正向引物Forwardprimer(5'→3')反向引物Reverseprimer(5'→3')擴增子長度Ampliconsize/bp備注RemarkP902CTAGTATATTGAAGGTTGAAGCATATTGCCAAAGCATTTTGTCCA2737擴增LOC_Os05g26902ORFAmplificationofLOC_Os05g26902ORFP926GTGGGTATCCAGCAAGTATTTCTGCATATTGCCAAAGCATTTTGTC2715擴增LOC_Os05g26926ORFAmplificationofLOC_Os05g26926ORFP890-1P890-2ATGTCCGTGCTTACCTGAGTGCACTTATCTAAGCACCTTGAGCGTTTGCAACTTATTGAAGGAACTGACTTACAACCTAGTCTTAGC22121584擴增LOC_Os05g26890ORFAmplificationofLOC_Os05g26890ORFP890-DTACAGGTTTGTCAAGAAGAAGTTGAGAAGAATACGGCAATAGGAT1364擴增LOC_Os05g26890下游序列AmplificationofLOC_Os05g26890downstreamP890-UAAGTGTCAATGCCAGTAGCCGTTGTTTCAGCCTCACTTAAAGA3635擴增LOC_Os05g26890上游序列AmplificationofLOC_Os05g26890upstream

1.2引物設計

根據前期定位結果,從NCBI網站和MUS數據庫獲得各預測ORF及其上下游堿基序列,用在線引物設計工具Primer 3 Plus進行引物設計(表1)。

1.3PCR擴增

參照王慧等[9]的方法提取水稻葉片基因組總DNA。取適量新鮮葉片放在2 mL離心管中加液氮搗碎,加入1 mL CTAB抽提液,搖勻;置于65 ℃水浴鍋或恒溫箱30～45 min后取出;加入氯仿-異戊醇(24∶1)至滿管,上下劇烈搖動混勻;15 000 r/min離心10 min后吸取上清液至新的滅菌離心管中,加入600 μL預冷的異丙醇后-20 ℃放置20 min,使DNA充分沉淀后10 000 r/min瞬間離心,立即倒掉液體,加入720 μL 70%乙醇洗滌;待DNA干燥后加入100 μL 1×TE Buffer,溶解DNA;置于-20 ℃保存、備用。

采用適合長片段高保真擴增的KOD FxTaq酶(TOYOBO,上海),PCR擴增體系按照說明書配制。反應條件為:94 ℃預變性5 min;98 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,68 ℃延伸2～4.5 min,32～35個循環(huán);68 ℃延伸10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.4序列比對分析

使用TIANgel Midi Purification Kit(天根生化公司,#DP130419)對擴增產物進行回收純化。具體操作參照試劑盒說明書。主要步驟:從瓊脂糖凝膠上割下帶有目的片段的凝膠塊到一個2 mL離心管中,加入1×Buffer GC,置于55～60 ℃熱板中約10 min直完全溶化。轉移混合液至帶收集管的吸附柱中離心。重復該步驟,直至剩余的混合液全部通過吸附柱。加入650 μL預熱的DNA 洗滌緩沖液(wash buffer)至吸附柱中,60 ℃靜置5 min。室溫下,13 000 r/min離心30 s。重復此步驟。轉移吸附柱至1.5 mL收集管中,加入30～50 μL預熱的洗脫液(Elution buffer)至吸附柱中央,室溫放置1 min,13 000 r/min離心1 min。

純化PCR產物送至Invitrogen公司測序,利用正反向引物雙向測序。測序堿基序列使用DNADynamo和CLC Sequence軟件拼接,并進行序列比對分析。

1.5半定量RT-PCR

突變體和野生型各組織總RNA提取方法參考文獻[10]。以第一鏈cDNA為模板,應用引物組合進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR程序如下:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。所用內參照基因為Actin1,所用引物為ActinF(5′-TCCTCTCTCTGTATGCCAGT-3′)和ActinR(5′-CGGAAACGCTCAGCACCAAT-3′),擴增片段長度為351 bp,PCR退火溫度為58 ℃。

$result = socket_listen($sock,4)or die(“socket_listen()fail:”.socket_strerror(socket_last_error()).“/n”);

2結果與分析

2.1候選基因預測

根據前期研究結果,候選基因被定位于第5染色體標記DL18和DL19之間[6],通過MSU Rice Genome Annotation Project Database(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)對定位區(qū)間進行候選基因預測(圖2)。預測得到3個ORF,其中2個編碼dnaJ分子伴侶(含有dnaJ結構域蛋白)LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1個為已克隆的水稻矮稈基因RGA1(LOC_Os05g26890)。

RGA1(D1,Dwarf1,DAIKOKUDWARF)基因是第一個克隆的水稻矮稈基因,編碼GTP結合蛋白(G蛋白)的α亞基,參與赤霉素(gibberellic acid,GA)信號傳導通路,影響糊粉層中α-淀粉酶的誘導和節(jié)間延長[11]。突變體材料HO541由于d1(dwarf1)基因的第1外顯子和內含子部分堿基缺失,導致GTP結合蛋白表達受到抑制,赤霉素信號傳導途徑受阻,從而產生矮桿、谷粒小而圓等性狀特征[3],與本研究cha-2突變表型高度相似,最有可能是候選基因。

圖2　iga-1定位區(qū)域的基因預測(http://rice.plantbiology.msu.edu)

位置Position區(qū)域RegionIR36日本晴Nipponbare特秈占13TXZ13cha-259外顯子ExonACCA379內含子IntronAA-A1315內含子IntronGGCG1359內含子IntronAATA

以‘日本晴’基因組作為參考序列,針對定位區(qū)間的3個預測ORF設計引物進行擴增和測序。序列比對結果發(fā)現,突變體cha-2和野生型‘特秈占13’在LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926的ORF序列完全一致,而LOC_Os05g26890則發(fā)生一些點突變(表2)。與野生型‘特秈占13’相比,cha-2存在4個SNP,其中3個位于內含子區(qū)域(+379、+1 315和+1 359),另外存在1個SNP(+59)是位于外顯子內。在+59這個堿基位點,IR 36與cha-2都是A,而‘日本晴’和‘特秈占13’都是C。通過編碼序列分析,發(fā)現此突變屬于同義突變,即密碼子ACA(IR 36與cha-2)/ACC(‘日本晴’和‘特秈占13’)都編碼蘇氨酸。由此表明,iga-1的突變位點并非位于RGA1基因CDS區(qū)域。

2.2預測候選基因的表達模式

基因表達水平往往對基因的功能活性具有顯著影響。前人研究表明,RGA1基因表達降低會產生矮稈性狀,因此,進一步調查突變體cha-2該基因的表達模式。選取‘特秈占13’、cha-2、cha-2n種子萌發(fā)期、二葉期、四葉期和分蘗期等4個發(fā)育時期,利用半定量PCR分析RGA1基因表達模式。結果表明,‘特秈占13’的預測基因均正常表達,且在分蘗期表達水平較高;而cha-2、cha-2n預測基因在上述時期均不表達(圖3)。上述結果表明,iga-1可能是RGA1表達缺陷型突變基因。

圖3　cha-2、cha-2n、特秈占13

為進一步研究突變體預測候選基因iga-1在不同遺傳背景下的表達情況,分別以‘中花11’和‘石狩白茅’作為輪回親本,構建了iga-1的基因導入系ZH11-iga1、SSBM-iga1。表型觀察發(fā)現,2個基因導入系均表現出矮化、葉色濃綠、圓小粒及直立緊湊小穗性狀,與cha-2相似。進一步利用半定量PCR檢測親本及2個導入系RGA1基因表達水平(圖4)。結果表明,‘中花11’、‘石狩白茅’均能檢測到RGA1正常表達;而2個導入系與突變體cha-2則均無法擴增得到目的片段。說明突變基因iga-1在不同遺傳背景中穩(wěn)定遺傳,且均表達缺失,進而引起植株的矮化等表型。

2.3候選基因RGA1序列分析

為了了解導致RGA1基因在突變體cha-2中表達缺失的原因,對候選基因RGA1 的上、下游區(qū)序列進行檢測,分析是否其轉錄表達的調控序列發(fā)生突變。

通過檢索NCBI數據庫,下載已報道的IR36的RGA1序列(GenBank登錄號L35844.1),擴增測序‘特秈占13’和cha-2的RGA1的上、下游區(qū)域。通過序列比對,發(fā)現三者基因下游約1 200 bp堿基序列完全一致,而在基因上游區(qū)域則發(fā)現cha-2存在大片段堿基缺失。以已克隆的IR36、H0541、‘日本晴’與‘特秈占13’、cha-2對RGA1的上游區(qū)域進行比對分析。結果(圖5)顯示,H0541(d1突變體)在第1外顯子和內含子區(qū)域缺失了833 bp,導致基因表達受抑制;而突變體cha-2缺失了包括第1外顯子整體、第1內含子部分以及轉錄起始上游區(qū)在內的865 bp。關鍵轉錄起始、調控位置大片段的缺失,理論上將導致基因表達失活,不具備正常功能。

圖4　候選基因RGA1在不同遺傳背景下的表型和表達情況

圖5　水稻RGA1基因部分結構及cha-2突變位置示意圖

方框序列分別表示CAAT-box和TATA-box;灰色背景方框序列表示轉錄起始位點;紅色背景堿基表示SNP位點

對RGA1轉錄起始上游區(qū)的序列分析(圖6)可以發(fā)現,該區(qū)域存在著TATA-Box及CAAT-Box等轉錄關鍵元件(基序)。前者功能在于結合RNA聚合酶,引導聚合酶準確識別轉錄的起始位點,而后者一般被認為控制著轉錄的起始頻率。cha-2在RGA1的轉錄起始關鍵位置的大片段缺失對該基因的轉錄是致命的,將導致RGA1完全無法表達,這與表達分析的結果相一致。

RGA1編碼GTP結合蛋白,是GA的傳導途徑的重要因子,對植株的正常生長和結實具有重要影響。由此判斷,矮稈突變體cha-2的矮稈基因iga-1正是沒有活性的RGA1基因,其轉錄關鍵區(qū)域的大片段缺失,導致無法正常轉錄表達,屬于GA信號傳導受阻型突變體。

3討論

RGA1基因在1995年以 IR36為材料進行了cDNA克隆,序列分析表明RGA1基因含有14個外顯子,編碼380個氨基酸的GTP結合蛋白α亞基。到目前為止,至少發(fā)現鑒定了7個該位點的等位變異,包括d1[11-12]、dwarf89[13]、dwarf69[14]、d1C6PS[15]、d1-8、d1-4和Epi-d1[16]等。d1等位基因由于第1外顯子和內含子的833 bp缺失造成GTP結合蛋白功能喪失,從而導致矮化。在植株生長正常的材料中,轉入G蛋白(GTP結合蛋白)α亞基的反義cDNA,其單株表現為d1基因類似的生長特征。dwarf89編碼區(qū)存在一個SNP(A-G),以致核苷酸編碼發(fā)生突變(由蘇氨酸突變?yōu)楸彼?,亞基螺旋變短進而無法J結合GSP,導致基因失活。dwarf69的5′上游區(qū)存在大片段(1 076 bp)插入導致突變體RGA1的表達顯著下降,從而造成植株矮化。EPI-d1的研究還發(fā)現了RGA1基因新的突變分子機制,啟動子區(qū)域的組蛋白和DNA甲基化修飾變異顯著地影響基因的表達造成植株株高的亞穩(wěn)定狀態(tài)。這些結果表明,新的d1等位基因的發(fā)現及研究會促進我們對G蛋白α構象的了解,從而揭示其與效應因子相互作用參與信號轉導的精細機制[15]。

水稻突變體cha-2是秈稻品種‘特秈占13’的空間誘變后代中選育出來的遺傳穩(wěn)定的矮稈突變體,前人的研究將控制基因iga-1精細定位在約32 kb的區(qū)間內。定位區(qū)間的預測基因LOC_Os05g-26890.1(即RGA1)是編碼GTP結合蛋白的相關基因,編碼區(qū)序列比對表明cha-2并沒有發(fā)生氨基酸編碼的突變,排除了基因區(qū)突變引起矮稈的預測?；虮磉_差異篩選是另一有效鑒定基因突變的手段,因此,通過半定量PCR分析,意外發(fā)現野生型原種的RGA1正常表達,而cha-2、cha-2n的RGA1在4個發(fā)育階段均為表達缺失。推測cha-2、cha-2n中因缺少或只攜帶無功能的G蛋白,導致GA信號傳導受到抑制,從而出現株高的矮化?；虮磉_的缺失,說明轉錄受到了致命性的阻礙,通過調控區(qū)域的測序發(fā)現RGA1上游序列出現大片段的缺失,并且缺失的區(qū)域涵蓋了轉錄起始、啟動子和第一外顯子等關鍵部位。分析表明,cha-2缺失了受RNA聚合酶識別活化的特異順式元件,不能形成具有RNA聚合酶活性的轉錄起始復合體,也不存在特異的轉錄起始位點進行啟動轉錄的過程。絕大多數矮化基因都是由于基因編碼區(qū)出現堿基的插入、缺失和替換所引起的突變得到的,與cha-2植株矮化的分子機理存在明顯不同。

GA信號傳導途徑對植物的生長是不可或缺的,cha-2能夠生長和結實,說明GA信號傳導在cha-2生物體內仍能夠完成,暗示RGA1功能缺失的情況下應還有其他基因承擔部分GA信號傳導的功能,因此突變體cha-2是研究GA信號傳導相關基因的特異材料。另一方面,G蛋白是調控動植物生長發(fā)育的重要信號傳導蛋白,G-蛋白α能夠與γ亞基互作,降低水稻營養(yǎng)生長期對氮的響應,增強氮的吸收和同化能力,進而提高收獲指數和產量[17]。通過調節(jié)G蛋白的活性可以改變水稻的氮響應,可以在適當減少氮肥施用量的條件下獲得水稻的高產。突變基因iga-1能夠在后代穩(wěn)定遺傳,這些矮稈分離個體表現出來矮稈、葉片直立挺拔、莖桿粗壯、著粒密等優(yōu)良性狀,具有同時改良品種多個性狀的潛力,能夠間接應用于品種選育。

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(編輯:宋亞珍)

Sequence Variation and Expression Analysis of Dwarf Geneiga-1 in Rice (OryzasativaL.)

CHEN Likai,LU Sulong,LIU Yongzhu,WANG Hui,CHEN Zhiqiang,GUO Tao*

(National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Abstract:In this study,we screened and confirmed the candidate gene of iga-1 in the fine mapping region,which controls the dwarf phenotype of mutation of cha-2,made clear the sequence variation and expression patterns of the gene,and explored its molecular mechanism of genetic regulation.Candidate gene in the mapping region was predicted using rice annotation database,and sequence variations of the ORF,upstream and downstream were analyzed based on sequencing and sequence alignment.Furthermore,meta-analysis of the crucial motif was performed.And expression pattern was investigated using semi-quantitative PCR.(1)On the basis of early studies of fine mapping of the nuclear genes iga-1,3 ORF were predicted in this study,including 2 dnaJ chaperones LOC_Os05g26902 and LOC_Os05g26926,and another one is the dwarf gene,RGA1( LOC_Os05g26890).(2)It is found that only several SNP were detected in the LOC_Os05g26890 in the mapping region between cha-2 and wild type by sequencing of ORFs,which appear to have no alteration of amino acid coding.(3)Expression analysis results show that RGA1 was unable to express in four developmental stages of cha-2 and was revealed inactivation in genetic background of ‘Zhonghua 11’ or ‘Shisoubaimao’ with genetic stability,which therefore was identified as candidate gene of iga-1.(4)The sequences in upstream and downstream of the RGA1 were examined,and 865 bp deletion was found in the upstream of RGA1 in cha-2,which was induced the whole exon 1,part of intron 1 and upstream region of transcription initiation.We concluded that the iga-1 in mutation of cha-2 was the inactivated RGA1 without normal expression,which was caused by a large fragment deletion in the key region of transcription.

Key words:rice (Oryza sativa L.);dwarf gene;deletion mutation;G protein α subunit;iga-1

中圖分類號:Q754;Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:陳立凱(1986-),男,在讀博士研究生,主要從事作物遺傳育種研究。E-mail:leeking1113@163.com*通信作者:郭濤,博士,教授,碩士生導師,主要從事水稻分子育種研究。E-mail:guo.tao@vip.163.com

基金項目:國家自然科學基金(31200250);國家“863”計劃(2012AA101201);廣州市對外科技合作項目(2014J4500030);現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-01-12)

收稿日期:2015-09-09;修改稿收到日期:2015-11-16

文章編號:1000-4025(2016)01-0001-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0001