王　麗,杜夏瑾,文　志,孫名皓,沈　昱,黎嘯峰

(中南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,長沙 410013)

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瀕危植物馬蹄參的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

王麗,杜夏瑾,文志,孫名皓,沈昱,黎嘯峰

(中南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,長沙 410013)

摘要:采用常規(guī)石蠟切片法觀察馬蹄參小孢子形成和雄配子體發(fā)育的過程,探討其瀕危機(jī)制與雄性生殖發(fā)育的關(guān)系,為馬蹄參的保護(hù)與繁殖提供基礎(chǔ)資料。結(jié)果表明:(1)花藥具4個花粉囊,花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層4層構(gòu)成,花藥壁的發(fā)育類型為基本型;(2)小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時胞質(zhì)分裂為同時型,四分體排列方式為四面體型;(3)成熟花粉為2-細(xì)胞型;(4)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)馬蹄參成熟花粉極面觀呈鈍三角形,赤道面觀呈長球形,具3個萌發(fā)孔。研究認(rèn)為,馬蹄參不存在雄性生殖結(jié)構(gòu)與發(fā)育過程異常。

關(guān)鍵詞:馬蹄參;小孢子發(fā)生;雄配子體形成;瀕危物種

馬蹄參(DiplopanaxstachyanthusHand.-Mazz.)隸屬于五加科(Araliaceae),常綠喬木,高15～25 m,主要分布在中國廣東、湖南、貴州、云南及越南北部,一般生長在海拔600～2 300 m的陰坡、溝谷溪旁等地方[1]。該種1928年首次被秦仁昌教授發(fā)現(xiàn),由意大利植物分類學(xué)家Handel-Mazzetti鑒定并命名[2]。馬蹄參一名來源于其胚彎曲,橫切面呈馬蹄型[3]。馬蹄參為第四紀(jì)冰川幸存的古老孑遺植物之一[2],由于生存環(huán)境遭到破壞,現(xiàn)存數(shù)量有限,在原有文獻(xiàn)記載的很多地方都未見其分布,已被列為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)植物和活化石植物[2,4-5]。

近年來,人們對馬蹄參的起源分布[6]、形態(tài)解剖學(xué)特征[3,7]、化學(xué)成分[8-9]以及古植物學(xué)[10-11]進(jìn)行了研究,但關(guān)于其有性生殖過程尚未見詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對馬蹄參的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行觀察研究,探討其瀕危機(jī)制與雄性生殖發(fā)育的關(guān)系,為馬蹄參的保護(hù)與繁殖提供基礎(chǔ)資料;另一方面,馬蹄參原屬五加科,現(xiàn)有學(xué)者建議將其納入山茱萸科(Cornaceae)[1-3,6-7],而有性生殖過程的研究可以為其系統(tǒng)分類學(xué)提供依據(jù)。

1材料和方法

馬蹄參的花序采自湖南莽山國家自然保護(hù)區(qū)和廣東南嶺國家自然保護(hù)區(qū),分別于2009～2013年4～8月采樣,在開花年份隔天采樣,并用改良FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=90∶6∶4)固定。

石蠟切片法制片[12-13],將材料切成厚7～10 μm的薄片,鐵礬-蘇木精或番紅-固綠染色,Nikon 80i顯微鏡觀察并照相。

將固定過的花藥用酒精逐級脫水后,置于乙酸異戊酯系列中脫水,每級10～20 min,第2天經(jīng)CO2臨界點(diǎn)干燥,把樣品粘于金屬臺上,再用鑷子搗碎花藥藥壁,在離子濺射儀上噴金、鍍膜,用日立S-3000N掃描電鏡觀察并拍照[14]。

2結(jié)果與分析

馬蹄參為總狀圓錐花序(圖版Ⅰ,1),花為兩性花,花萼5,花瓣5,雄蕊10枚,排成2輪。花期一般為6～7月,花藥由4個花粉囊構(gòu)成,呈左右對稱排列,中間通過藥隔相連(圖版Ⅰ,2)?；ǚ勰沂怯赏鈱拥哪冶诤蛢?nèi)生的花粉粒組成。早期花蕾中,花托上產(chǎn)生雄蕊原基,進(jìn)而形成花藥原始體?；ㄋ幵俭w是由1層表皮細(xì)胞包裹著一群活躍的幼嫩細(xì)胞組成(圖版Ⅰ,3)。4月底,原始體表皮下觀察到四個角隅快速分裂的細(xì)胞即孢原細(xì)胞(圖版Ⅰ,4)。

2.1小孢子囊壁發(fā)育

孢原細(xì)胞經(jīng)第一次有絲分裂形成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞(圖版Ⅰ,5),分裂方式為平周分裂。5月初,初生壁細(xì)胞平周分裂形成2層次生壁細(xì)胞(圖版Ⅰ,6),外層的次生壁細(xì)胞進(jìn)一步分裂形成藥室內(nèi)壁和1層中層,內(nèi)層的次生壁細(xì)胞分裂形成1層中層和絨氈層,此時次生壁基本形成,從外到內(nèi)依次為表皮層、藥室內(nèi)壁、2層中層和1～2層絨氈層(圖版Ⅰ,7),根據(jù)花藥壁形成方式的劃分[15],馬蹄參花藥壁的發(fā)育類型屬于基本型。小孢子母細(xì)胞形成期,花藥壁完全分化,并通過不斷的垂周分裂適應(yīng)小孢子囊內(nèi)部組織的增長。表皮細(xì)胞核大,呈方形,排列松散;藥室內(nèi)壁細(xì)胞呈扁平形,單核延長,徑向壁延長,以適應(yīng)小孢子囊內(nèi)部組織的變化,并開始木質(zhì)化;中層細(xì)胞被表皮細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞擠壓,呈矩形,細(xì)胞狹長,核小,細(xì)胞質(zhì)稀少;絨氈層細(xì)胞發(fā)育達(dá)到高峰,細(xì)胞逐漸變大,細(xì)胞質(zhì)變濃,以單核或雙核形態(tài)存在(圖版Ⅰ,8)。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期中層細(xì)胞開始解體;絨氈層細(xì)胞的徑向壁和內(nèi)切向壁逐漸消失解體,細(xì)胞原生質(zhì)向內(nèi)收縮。質(zhì)膜部分與細(xì)胞質(zhì)相連,部分分離(圖版Ⅰ,9)。四分體形成期藥室內(nèi)壁細(xì)胞木質(zhì)化程度加大;中層細(xì)胞進(jìn)一步解體,變成一薄層;絨氈層細(xì)胞開始解體,細(xì)胞中出現(xiàn)液泡,細(xì)胞質(zhì)較淺(圖版Ⅰ,10)。游離小孢子期中層細(xì)胞完全消失,絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步解體,細(xì)胞內(nèi)切向壁消失,但內(nèi)膜仍存在,使其營養(yǎng)物質(zhì)通過內(nèi)膜釋放到小孢子囊內(nèi)(圖版Ⅰ,11)?；ǚ鄢墒炱谛℃咦幽冶谥皇１砥雍屠w維化的藥室內(nèi)壁(圖版Ⅰ,12)。

2.2小孢子發(fā)生

5月中旬,初生造孢細(xì)胞經(jīng)多次分裂,形成小孢子母細(xì)胞(圖版Ⅰ,7)。隨著小孢子母細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育,細(xì)胞核增大,細(xì)胞質(zhì)變濃,細(xì)胞壁與質(zhì)膜間出現(xiàn)胼胝質(zhì)壁 (圖版Ⅰ,8) 。小孢子母細(xì)胞發(fā)育到一定階段,開始準(zhǔn)備進(jìn)行減數(shù)分裂,此時的細(xì)胞質(zhì)濃稠,細(xì)胞核大(圖版Ⅰ,9)。第一次細(xì)胞核分裂完成后不形成細(xì)胞壁,直接進(jìn)入第二次細(xì)胞核分裂(圖版Ⅰ,13),形成4個核,在4個核之間會產(chǎn)生細(xì)胞壁,同時分隔形成4個細(xì)胞,即四分體,四分體為共同的胼胝質(zhì)包圍,4個小孢子之間也為明顯的胼胝質(zhì)體所分開(圖版Ⅰ,14)。從小孢子母細(xì)胞整個分裂過程可知,其減數(shù)分裂的類型為同時型。四分體的主要排列方式為四面體型(圖版Ⅰ,10),四分體發(fā)育到后期胼胝質(zhì)體逐漸消失,小孢子細(xì)胞壁形成、加厚,彼此分離,發(fā)育成游離小孢子。

2.3雄配子體形成

游離小孢子最初體積較小,呈橢圓形,核大,位于細(xì)胞中央(圖版Ⅰ,15)。隨著小孢子體積的增大,細(xì)胞壁加厚,細(xì)胞核向細(xì)胞邊緣移動,進(jìn)入單核靠邊期(圖版Ⅰ,16)。隨后,小孢子細(xì)胞核靠近細(xì)胞壁處進(jìn)行有絲分裂,形成一大一小2個核,較大的為營養(yǎng)核,較小的為生殖核(圖版Ⅰ,17)。二核細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育,細(xì)胞內(nèi)液泡消失,花粉壁加厚,花粉粒發(fā)育成熟,以二核形態(tài)進(jìn)行傳粉(圖版Ⅰ,18)。通過掃描電鏡觀察,成熟花粉粒極面觀鈍三角形,赤道面觀長球形,具3個萌發(fā)溝,延伸至兩極,溝區(qū)明顯,表面紋飾為擬網(wǎng)狀,有分布均勻的孔穴(圖版Ⅰ,19、20)。

3討論

3.1馬蹄參的胚胎學(xué)特征

本研究通過對馬蹄參小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn):雄蕊10枚,排成2輪,內(nèi)輪和外輪均發(fā)育正常,而非《中國植物志》中所描述的5個常不育[16]。雄蕊花藥具有4個孢子囊,兩側(cè)孢子囊間藥隔較窄;花藥壁發(fā)育類型為基本型,由四部分構(gòu)成,由外到內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層(1～2層)和絨氈層(1～2層)。絨氈層在退化過程中,細(xì)胞內(nèi)切向壁消失,但是內(nèi)膜仍存在,使得其營養(yǎng)物質(zhì)通過內(nèi)膜釋放到小孢子囊內(nèi),屬于腺質(zhì)型;小孢子母細(xì)胞的胞質(zhì)分裂為同時型,同一藥室內(nèi)的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂基本同步,同一花藥不同藥室的減數(shù)分裂也基本同步,但同一朵花中不同花藥之間的減數(shù)分裂不一定完全同步,相差1～2個時期,是植物適應(yīng)環(huán)境的一種進(jìn)化表現(xiàn),對種群繁殖具有重要意義;小孢子四分體排列方式為四面體型;成熟的花粉粒為2-細(xì)胞型。根據(jù)資料顯示,本實(shí)驗(yàn)首次揭示了馬蹄參的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程。

3.2馬蹄參瀕危的生殖生物學(xué)原因

植物有性生殖過程十分關(guān)鍵,任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致生殖失敗,進(jìn)而引起植物瀕危[17-18]。故通過對馬蹄參胚胎發(fā)育過程的研究,有助于揭示其瀕危原因,并進(jìn)一步提出保護(hù)措施。通過對小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程的觀察,未見有敗育及其它異?，F(xiàn)象。關(guān)于瀕危植物南川升麻[19]、木根麥冬[20]、鵝掌楸[21]、高山紅景天[22-23]等研究表明,引起植物瀕危的內(nèi)因包括:花粉母細(xì)胞不能進(jìn)行正常減數(shù)分裂;異株授粉導(dǎo)致花粉限制;4個孢子大小不等;花粉表面光滑,降低受精的可能性以及絨氈層提前發(fā)育、過早解體、肥大生長以及延遲退化等。其中絨氈層與花粉發(fā)育有密切關(guān)系[24-25],而馬蹄參的花藥壁發(fā)育過程中并未出現(xiàn)絨氈層異常。另外,馬蹄參雄性可育,敗育花粉粒所占比例可以忽略。綜上所述,馬蹄參不存在雄性生殖結(jié)構(gòu)與發(fā)育過程異常等因素,可以從大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程、受精過程、種子萌發(fā)、種子活力以及幼苗生長情況等方面尋找其瀕危原因。

引起植物瀕危的因素很多,生殖力、存活力、適應(yīng)力低下等內(nèi)在因素是其走向?yàn)l危的根本原因,種群生活史多個脆弱環(huán)節(jié)疊加作用,也可導(dǎo)致個體生長發(fā)育不良和早衰[26],此外,外部因素包括自然因素、歷史因素和人為因素等[27-28]是植物瀕危的主要推動力。研究認(rèn)為馬蹄參處于比較原始的演化水平[3];在群落優(yōu)勢種種群徑級分布上,馬蹄參表現(xiàn)為衰退型,該樹種的幼苗在林下更新狀況不良,隨著群落的進(jìn)展演替,該種將會被取代[29];馬蹄參枝的性狀變異大,即受外界條件特別是溫度、坡度和土壤等環(huán)境因子的影響較大,表明馬蹄參對外界環(huán)境條件的反應(yīng)不夠敏感,環(huán)境適應(yīng)能力低下,生存力較弱,這也可能是其瀕危的主要原因之一[30]。

3.3馬蹄參胚胎發(fā)育的系統(tǒng)學(xué)意義

關(guān)于馬蹄參系統(tǒng)位置前人已做了大量工作,爭論主要集中在五加科(Araliaceae)和山茱萸科(Cornaceae)上:馬蹄參屬的花部特征與五加科植物相近,奧地利植物分類學(xué)家根據(jù)其具花標(biāo)本將其歸為五加科[2];曾滄江[31]將馬蹄參與古植物TectocaryarhenanaF.Kirchh.進(jìn)行比較,正式將其置于山茱萸科;Eyde等[11]將馬蹄參的果實(shí)與單室山茱萸類Mastixioides的果實(shí)化石進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)二者的種子室均為馬蹄形,有一槽型內(nèi)果皮突入子房室,認(rèn)為馬蹄參應(yīng)劃分到Mastixicarpum中;朱偉華等[3]通過對馬蹄參的解剖學(xué)特征進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)其葉表面、花瓣及花萼上著生單細(xì)胞的二叉毛,不具分泌道,子房一室一胚珠等特征與五加科特征不一致;另外,李耀利等[32]對單室山茱萸屬27個類群的rbcL進(jìn)行分析,認(rèn)為將馬蹄參歸為山茱萸科較為合適。

由于植物生殖生物學(xué)特征較少受環(huán)境變化的影響而在系統(tǒng)進(jìn)化過程中十分保守,歷來在系統(tǒng)學(xué)及分類學(xué)上是重要的研究內(nèi)容,故可以作為判定種群親緣關(guān)系的重要依據(jù)[33]。研究結(jié)果表明,馬蹄參的許多生殖生物學(xué)特征與山茱萸科一致,如:4個花粉囊、2-細(xì)胞花粉、分泌型絨氈層、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時的胞質(zhì)分裂為同時型、花粉具3個萌發(fā)溝并具有網(wǎng)狀紋飾,但是否能將這些特征作為依據(jù)將馬蹄參劃分到山茱萸科,還有待于進(jìn)一步研究。

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圖版 Ⅰ馬蹄參小孢子發(fā)生和雄配子體形成

EP.表皮細(xì)胞;EN.藥室內(nèi)壁;M.中層;T.絨氈層

1.馬蹄參的花序;2.每個花藥具4個藥室;3.花藥原基;4.雄性孢原細(xì)胞;5.孢原細(xì)胞分裂;6.初生壁細(xì)胞平周分裂;7.次生壁形成,同時初生造孢細(xì)胞經(jīng)多次分裂,形成小孢子母細(xì)胞;8.小孢子母細(xì)胞時期;9.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期,中層細(xì)胞開始解體;10.四分體時期,中層細(xì)胞進(jìn)一步解體,絨氈層細(xì)胞開始解體;11.游離小孢子時期,中層細(xì)胞完全消失,絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步解體;12.花粉成熟期,小孢子囊壁只剩表皮7層和纖維化的藥室內(nèi)壁;13.小孢子母細(xì)胞減數(shù)第一次分裂后不形成細(xì)胞壁;14.四分體;15.早期小孢子;16.游離小孢子單核靠邊期;17.花粉核有絲分裂形成一個營養(yǎng)核和一個生殖核;18.成熟的二核花粉粒;19.成熟花粉粒的電鏡掃描圖(極面觀);20.成熟花粉粒的電鏡掃描圖(赤道面觀)。

Plate ⅠMicrosporogenesis and development of male gametophyte inDiplopanaxstachyanthusHand.-Mazz.

Ep.Epidermis;EN.Endothecium;M.Middle layer;T.Tapetum

Fig.1.Inflorescence ofDiplopanaxstachyanthusHand.-Mazz.;Fig.2.Anthers with four anther rooms;Fig.3.Anther primordia;Fig.4.Male archespore;Fig.5.Archesportial cells division;Fig.6.The periclinal division of primary parietal cell;Fig.7.The anther wall have formed,and the primary sporogenous cell formed the microspore mother cells after division;Fig.8.Microspore mother cell stage;Fig.9.Microspore mother cell meiosis,the middle cells were partially degraded;Fig.10.Tetrad stage,the middle layer became thinner,and the tapetum was degenerated;Fig.11.Free microspores stage,the middle layer disappeared completely and the tapetal cells continued to change;Fig.12.The anther wall consists of epidermis and fibrous-thickened endothecium in the stage of mature pollen;Fig.13.Microsporocyte atⅠof meiosis,no cell wall formed between two nuclei;Fig.14.Tetrad;Fig.15.Early microspore;Fig.16.Uninucleate microspore with a big vacuole;Fig.17.Mitosis of uninucleate microspore gave rise to a large vegetative nucleus and a small generative nucleus;Fig.18.The 2-celled pollen grain;Fig.19.Pollen grain in polar view;Fig.20.Pollen grain in equatorial view.

(編輯:潘新社)

Microsporogenesis and Development of Male Gametophyte in Endangered SpeciesDiplopanaxstachyanthusHand.-Mazz.

WANG Li,DU Xiajin,WEN Zhi,SUN Minghao,SHEN Yu,LI Xiaofeng

(School of Life Sciences,Central South University,Changsha 410013,China)

Abstract:Here we characterize microsporogenesis and development of male gametophytes by using paraffin sections to study the relationship between the endangered mechanism and the male reproductive development.In addition,the study provides a basic information for the protection and propagation of Diplopanax stachyanthus Hand.-Mazz.The results are as follows:(1)anthers are tetrasporangiate,and the microsporangium wall is composed of epidermis,endothecium,middle layers and tapetum.The development type of anther wall is of basic type;(2)cytokinesis during meiosis of microspore mother cells(MMCs) is simultaneous,and the tetrad is tetrahedral;(3)the nature pollen is two-celled;(4)scanning electron microscope observation shows that it is obtuse-triangular in pole view and oblong-globose in equatorial view,with three apertures.The study suggests that there is no abnormal development of male reproductive structure of D.stachyanthus Hand.-Mazz..

Key words:Diplopanax stachyanthus Hand.-Mazz.;microspore;male gametophyte;endangered species

中圖分類號:Q944.58

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:王麗(1976-),女,博士,副教授,從事瀕危植物保護(hù)方面的研究工作。E-mail:wangli@csu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31270700,30800088);湖南省自然科學(xué)基金(13JJ2006)

收稿日期:2015-09-06;修改稿收到日期:2015-10-30

文章編號:1000-4025(2016)01-0043-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0043