蘭創(chuàng)業(yè),劉　釗,賈曉軍,周　進(jìn)

(1 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,太原 030031;2 新疆建設(shè)兵團(tuán) 第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆五家渠市 831300)

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轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因大白菜新種質(zhì)的獲得及其抗蟲性分析

蘭創(chuàng)業(yè)1,劉釗1,賈曉軍2,周進(jìn)2

(1 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,太原 030031;2 新疆建設(shè)兵團(tuán) 第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆五家渠市 831300)

摘要:采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)方法,將雙價(jià)抗蟲基因BmkIT-Chitinase導(dǎo)入早熟型大白菜自交系20-19-3,最終獲得了5個(gè)轉(zhuǎn)基因大白菜優(yōu)良自交系純合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以轉(zhuǎn)基因大白菜株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隇椴牧?對(duì)BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遺傳規(guī)律、基因表達(dá)及抗蟲性進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示:(1)轉(zhuǎn)化株后代多代(T1～T4) PCR、Southern blotting等分子跟蹤檢測(cè)表明,目的基因已成功導(dǎo)入受體植株,且能夠穩(wěn)定遺傳;用該轉(zhuǎn)基因方法對(duì)大白菜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化所獲得的轉(zhuǎn)基因植株分析顯示,外源基因多數(shù)以多拷貝形式整合于核基因組,少部分外源基因以單拷貝形式整合。(2)Elisa 分析結(jié)果證明,所導(dǎo)入的外源基因可高效表達(dá),T4代株系新鮮葉片中表達(dá)產(chǎn)物量最高達(dá)到0.069 μg·g-1左右。(3)轉(zhuǎn)基因株系田間抗蟲性統(tǒng)計(jì)分析表明,轉(zhuǎn)化株系與對(duì)照在抗蟲性方面有顯著差異,其對(duì)小菜蛾及菜青蟲抗性普遍提高2～3級(jí)。研究認(rèn)為,轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表達(dá)可有效提高大白菜的抗蟲性。

關(guān)鍵詞:大白菜;花粉介導(dǎo);BmkIT基因;Chitinase基因;雙價(jià)抗蟲基因

大白菜(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis)起源于中國(guó),又稱結(jié)球白菜、白菜等,是中國(guó)乃至亞洲重要的栽培食用蔬菜之一。由于其富含維生素、糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,深受廣大消費(fèi)者喜食。但在大白菜的栽培過程中,蟲害一直是影響其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)及品質(zhì)的重要制約因素,其中,菜青蟲(PierisrapaeL.)、菜螟(Hellulaundalis)和小菜蛾(Plutellaxylostella)等鱗翅目昆蟲對(duì)其危害尤為嚴(yán)重[1]。由于白菜類蔬菜作物中缺乏有效的抗蟲資源,無法通過常規(guī)手段培育出抗蟲白菜類蔬菜作物品種[2]。因此通過生物技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化及改造成為大白菜轉(zhuǎn)基因育種研究的重要內(nèi)容。

近年來,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)等轉(zhuǎn)基因方法,已經(jīng)相繼獲得了轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因[3]、馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因[4]、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因[5-6]、慈姑胰蛋白酶抑制基因[6]和蘇云金芽孢桿菌基因[7]等抗蟲大白菜新種質(zhì),但國(guó)內(nèi)外最主要的、應(yīng)用最廣泛還是源自蘇云金芽胞桿菌基因的轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab和cry1Ac白菜[7]。盡管如此,轉(zhuǎn)基因抗蟲大白菜與其它轉(zhuǎn)基因抗蟲作物(轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白基因玉米、棉花等)相比,其抗蟲性普遍較差,這可能與抗蟲目的基因在白菜類蔬菜作物中的表達(dá)水平偏低有關(guān)[1];另外,單抗蟲基因的轉(zhuǎn)化,抗蟲譜較窄,它只對(duì)某幾種或一小類害蟲具有毒殺作用,易使害蟲產(chǎn)生耐受性。因此,開發(fā)培育新型抗蟲基因,聯(lián)合使用2種或2種以上不同殺蟲機(jī)制的抗蟲基因?qū)Υ蟀撞宿D(zhuǎn)化是極其重要的。

昆蟲特異性蝎神經(jīng)毒素是來源于東亞鉗蝎神經(jīng)毒素中的一種富含生物活性的多肽物質(zhì),其對(duì)昆蟲有專一性麻痹致死作用,而對(duì)哺乳動(dòng)物無害或毒性很小,因而被廣泛應(yīng)用于生物殺蟲劑和抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的研究[8]。在轉(zhuǎn)蝎神經(jīng)毒素基因抗蟲植物研究方面,Barton等[9]首先將昆蟲蝎毒素基因AaIT、BeIT1和BeIT2等轉(zhuǎn)入煙草,表明了其對(duì)棉鈴蟲幼蟲有較強(qiáng)的致死性。姚斌等[10]將蝎毒素基因AaIT基因轉(zhuǎn)入煙草,監(jiān)測(cè)到殺蟲活性。Wu等[11]也將昆蟲蝎毒素基因AaHIT基因轉(zhuǎn)入棉花中,使其對(duì)棉鈴蟲的致死率到44%～98%。而對(duì)于鱗翅目昆蟲而言,幾丁質(zhì)是其消化道內(nèi)壁和身體表皮的重要組成部分,昆蟲在蛻皮時(shí)分泌幾丁質(zhì)酶以分解幾丁質(zhì),并蛻掉舊皮。如果將昆蟲幾丁質(zhì)酶導(dǎo)入植物,使其在植物中持續(xù)表達(dá),就會(huì)阻止入侵害蟲的正常發(fā)育,從而起到保護(hù)植物的作用。在轉(zhuǎn)昆蟲幾丁質(zhì)基因抗蟲植物研究方面,Gopalakrishnan等[12]首次將煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因插入苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒中,使其對(duì)草地貪夜蛾半致死時(shí)間大大下降。Ding等[13]也將煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因通過農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草中,獲得了抗煙蚜轉(zhuǎn)基因植株,但對(duì)煙草天蛾幼蟲抗蟲性不明顯。郝曜山等[14]將煙草夜蛾幾丁質(zhì)酶基因與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素基因雙價(jià)基因?qū)胗衩字?所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米植株對(duì)玉米螟表現(xiàn)出明顯抗蟲性。在轉(zhuǎn)基因植物安全性日益受到重視的情況下,對(duì)這2種基因轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究并完善,將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。

本研究通過自己發(fā)明的超聲波輔助花粉介導(dǎo)的方法,將克隆構(gòu)建的含有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmkIT[7]與具有廣譜殺蟲作用的煙草夜蛾幾丁質(zhì)酶基因Chitinase[7]的雙價(jià)抗蟲基因,導(dǎo)入早熟型大白菜自交系20-19-3中,獲得了包含BmkIT和Chitinase基因的轉(zhuǎn)基因植株,通過對(duì)轉(zhuǎn)化株后代進(jìn)行多代的PCR、Southern blotting等分子跟蹤檢測(cè)及田間抗蟲性鑒定和觀察,最終獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase雙價(jià)抗蟲基因大白菜。并證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株及其后代對(duì)2種鱗翅目昆蟲的抗性作用,豐富了轉(zhuǎn)基因大白菜抗蟲材料。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用受體材料為早熟型大白菜自交系20-19-3,株高40 cm,開展度35 cm×35 cm,生育期50 d,外葉綠色,葉肋成白色,黃心,在太原地區(qū)周年可以種植。由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培育。

研究使用的農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404,重組質(zhì)粒pBI101-BmkIT-chi攜有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因(BmKIT)、煙草夜蛾幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase)及nptⅡ抗性基因等,載體所用的啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒的CaMV-35s啟動(dòng)子,終止子為Ti質(zhì)粒中胭脂堿合成酶基因的終止序列nos,該菌株質(zhì)粒由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心提供(圖1)。

1.2轉(zhuǎn)化和篩選

將經(jīng)過低溫春化處理的大白菜自交系20-19-3幼苗,于春天移栽入專用實(shí)驗(yàn)田,在其開花期每日上午10:00～11:00采集新鮮花粉,置于200 g/L蔗糖緩沖溶液中進(jìn)行超聲波預(yù)處理,超聲波預(yù)處理參數(shù)為功率100 W,工作時(shí)間5 s,間隔15 s,工作5次。加入質(zhì)粒DNA后,再次對(duì)花粉懸浮液進(jìn)行超聲波處理,處理功率150 W,其他參數(shù)同前。將處理好的花粉滴加100 mg/L硼酸和200 mg/L硝酸鈣后快速涂抹于待轉(zhuǎn)化柱頭上,以促進(jìn)其花粉萌發(fā)。授粉后用防蟲網(wǎng)袋隔離并標(biāo)記。

圖1　質(zhì)粒pBI101-BmkIT-Chitinase

將收獲的T0代種子用70%酒精滅菌后播于鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中,卡那霉素發(fā)芽篩選濃度為150 mg /L,28 ℃下光照培養(yǎng),3～4 d后根據(jù)其出芽情況,子葉及真葉顏色變化,初步篩選確定卡那霉素抗性苗,并將其移到營(yíng)養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng),待苗壯后于4℃下低溫春化處理 1月,轉(zhuǎn)到大盆并置于溫室栽培,準(zhǔn)備進(jìn)行分子檢測(cè)并通過蕾期授粉以收獲種子得到自交后代。

1.3轉(zhuǎn)化株DNA提取及PCR檢測(cè)

取其嫩葉提取總DNA,提取DNA方法采用本單位改良的CTAB 法[15](提取緩沖液中加入0.5%乙基黃原酸鉀,將NaCI的濃度提高至2.5 mol/L,可使大白菜提取的DNA濃度及質(zhì)量大大提高)。使用提取的卡那霉素抗性植株DNA模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增過程中以未轉(zhuǎn)化大白菜基因組DNA 為陰性對(duì)照,無菌水為空白對(duì)照,質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。

Chitinase基因上游引物(5′-ATGCGAGCGA-CACTGG-3′)和下游引物(5′-TTGACATTCGCG-AGC-3′),擴(kuò)增片段大小為1 800 bp。擴(kuò)增采用20 μL體系,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物4 ℃保存,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

BmkIT基因上游引物(5′-ATGAAATTTTTC-CTTATA-3′)和下游引物(5′-TTAACCAATTAT-TTGGAC-3′),擴(kuò)增片段大小為280 bp。擴(kuò)增時(shí)采用20 μL體系,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸10 min。保存PCR產(chǎn)物,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

將重復(fù)均擴(kuò)增出2個(gè)外源基因陽(yáng)性條帶的植株確定為轉(zhuǎn)化株。引物合成是由上海生工生物工程公司完成。

1.4轉(zhuǎn)基因植株Southern blotting檢測(cè)

將PCR 檢測(cè)T2代呈陽(yáng)性株的大白菜提取總DNA為待測(cè)樣品,以非轉(zhuǎn)基因大白菜DNA為陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒DNA,用HindⅢ酶對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行酶切,將酶切產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離,進(jìn)行Southern blotting雜交檢測(cè)。試驗(yàn)中,DNA探針分別使用外源基因Chi基因1 800 bp和Bmk基因280 bp的全長(zhǎng)基因。Southern blotting試驗(yàn)按照Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit試劑盒的說明書進(jìn)行。具體實(shí)驗(yàn)如DNA 變性、轉(zhuǎn)移及雜交方法,雜交后用X-光片自顯影曝光參照《分子克隆》[16]。

1.5轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因白菜的Elisa檢測(cè)

為對(duì)外源雙價(jià)抗蟲基因在受體內(nèi)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,選取Chitinase標(biāo)準(zhǔn)樣品按每孔100 ng(1/10)n,n=1～10的標(biāo)準(zhǔn)稀釋10個(gè)濃度梯度,作為陽(yáng)性對(duì)照,以水為空白;以非轉(zhuǎn)化大白菜蛋白為陰性對(duì)照,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有樣品的405 nm光吸收值均取3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值[17]。

1.6轉(zhuǎn)化大白菜抗蟲鑒定

(1)田間網(wǎng)室抗蟲鑒定選取3代以上穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因白菜于專用溫室內(nèi)鑒定。材料于2014年4月播種育苗,待幼苗4葉1心后將其移栽入溫室中,和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻撞藛涡蟹N植,每份材料種植重復(fù)3次。取羽化歷期基本一致的小菜蛾成蟲(雌雄各半)按蟲苗比1∶10接蟲。2～3周后對(duì)葉片危害情況進(jìn)行調(diào)查。

(2)田間抗蟲鑒定選取3代以上穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因白菜與非轉(zhuǎn)基因大白菜,在實(shí)驗(yàn)田內(nèi)雙行相間種植,全生育期少打或不打農(nóng)藥防治,在春秋兩季菜青蟲高發(fā)期進(jìn)行田間統(tǒng)計(jì)觀察分析。

(3)實(shí)驗(yàn)室菜青蟲飼喂實(shí)驗(yàn)選取3代以上穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因白菜與非轉(zhuǎn)基因大白菜,在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行菜青蟲飼喂實(shí)驗(yàn)。菜青蟲為田內(nèi)人工抓取,每培養(yǎng)皿接蟲10條,放大小基本相同葉片飼喂12 h后拍照觀察并分析統(tǒng)計(jì)。

以上鑒定方法均根據(jù)葉片的咬食情況分級(jí),抗性分級(jí)參考王欣[18]的抗性調(diào)查方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。咬食級(jí):網(wǎng)室田間鑒定危害情況;0級(jí)無蟲:全部葉片生長(zhǎng)正常;1級(jí)有蟲:葉片有輕微危害癥狀,有小孔,但小孔不相連;3級(jí)有蟲:葉片危害癥狀較嚴(yán)重,葉片小孔相連,但葉片完整;5級(jí)有蟲:葉片危害癥狀嚴(yán)重,葉片有大洞,但葉片基本完整或有大量葉片殘余;7級(jí)有蟲:葉片危害癥狀極為嚴(yán)重,葉片僅剩葉脈及不完整葉片。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因大白菜T0代種子的獲得及其卡那霉素抗性初步篩選

將超聲波處理過的含有外源基因雙價(jià)抗蟲基因表達(dá)構(gòu)件pBI101-BmkIT-Chi的大白菜花粉,人工涂抹于待轉(zhuǎn)化花序(蕾期)上。共處理大白菜30株,由于處理后的花粉萌發(fā)率較低,最終獲得T0代種子6 000余粒。

轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因大白菜應(yīng)同時(shí)被賦予卡那霉素抗性,本試驗(yàn)對(duì)T0代種子進(jìn)行了卡那霉素抗性篩選。首先,分別將非轉(zhuǎn)基因大白菜種子在鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),浸濕濾紙附加卡那霉素濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mg/L[19],最終可以看到150 mg/L濃度正好可抑制全部非轉(zhuǎn)基因大白菜的種子正常生長(zhǎng)萌動(dòng)后子葉發(fā)黃以至死亡(圖2,A),因此,以濃度150 mg/L定為導(dǎo)入后代的卡那霉素抗性篩選濃度。最終在該濃度下T0代種子培養(yǎng)共獲得T1代抗性苗57株。

2.2轉(zhuǎn)基因大白菜PCR檢測(cè)

將初步獲得的卡那霉素抗性苗繼續(xù)培養(yǎng)并移栽到溫室。待苗壯后全部取樣并提取總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。重復(fù)3次。結(jié)果表明,T1代植株擴(kuò)增出約為1 800 bpChitinase基因特異條帶的陽(yáng)性植株有26株,擴(kuò)增出約280 bpBmkIT基因特異條帶的陽(yáng)性植株有31株,雙基因同時(shí)被檢測(cè)到的陽(yáng)性植株為25株。PCR結(jié)果條帶清晰,少有雜帶,和陽(yáng)性對(duì)照大小一致;陰性對(duì)照、水對(duì)照均未擴(kuò)增出目的條帶,雙基因同時(shí)檢出重合率較高,表明操作過程中無污染,結(jié)果可靠。圖3為部分轉(zhuǎn)基因株系的檢測(cè)結(jié)果。

T1代雙抗蟲基因檢測(cè)為陽(yáng)性植株經(jīng)蕾期人工自交授粉獲得后代種子,經(jīng)低溫春化后繼續(xù)種植獲得T2代轉(zhuǎn)基因大白菜,對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè),檢測(cè)陽(yáng)性植株繼續(xù)種植,連續(xù)3代PCR跟蹤(表1只列出了部分典型材料統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果)。

從表1中可以看到,利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化所獲得的T1代株系在其后代多代PCR分子檢測(cè)時(shí),如果把所獲得的目的性狀外源基因作為顯性性狀的話,按照孟德爾分離規(guī)律理論,其T2、T3和T4代檢測(cè)陽(yáng)性比率在后代整個(gè)群體中性狀分離比率應(yīng)為3∶1、5∶1與9∶1,但在實(shí)際檢驗(yàn)時(shí)其分離比率出現(xiàn)3種情況,如表1中Z1-5、Z2-7轉(zhuǎn)化事件中,其檢測(cè)結(jié)果后代分離比率與預(yù)期比率是基本擬合的,符合孟德爾遺傳分離規(guī)律,但這部分材料只占所獲得轉(zhuǎn)化事件1/5;另一情況材料在所獲得轉(zhuǎn)化事件中占大多數(shù),如Z2-3、Z5-1檢測(cè)結(jié)果顯示,其T2代似乎就已經(jīng)高度純合,檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于理論值,不符合孟德爾遺傳,考慮到所使用的轉(zhuǎn)基因方法,推測(cè)這些轉(zhuǎn)化事件中,外源基因并不是以單拷貝存在,而是多拷貝,多整合位點(diǎn)存在;第三種情況只在個(gè)別轉(zhuǎn)化事件中發(fā)現(xiàn),如Z7-3。T2代材料檢測(cè)中只表現(xiàn)出極低的陽(yáng)性率,將陽(yáng)性植株再種植到T3代時(shí)未能檢測(cè)出陽(yáng)性植株。

A.非轉(zhuǎn)基因種子在150 mg/L濃度卡那霉素水溶液培養(yǎng)(CK1);B.T0代轉(zhuǎn)化種子在150 mg/L濃度

轉(zhuǎn)化事件No.ofsamplesT2(預(yù)期陽(yáng)性率75%)T2generation(expectableratio75%)陽(yáng)性率Requencyofpositiveresult/%χ2PT3(預(yù)期陽(yáng)性率83%)T3generation(expectableratio83%)陽(yáng)性率Requencyofpositiveresult/%χ2PT4(預(yù)期陽(yáng)性率90%)T4generation(expectableratio90%)陽(yáng)性率Requencyofpositiveresult/%χ2PZ1-580.41.30.25187.61.00.31393.51.00.301Z2-395.721.8097.212.80.00399.59.00.002Z2-765.24.60.03082.60.10.95088.50.10.738Z5-189.210.00.00187.50.90.32593.20.80.368Z7-310.5218.000--0--Z9-655.619.1075.43.90.04685.20.91.171

M.DL2000;P.陽(yáng)性對(duì)照;B.空白水對(duì)照;N.陰性對(duì)照;(A)1～18、(B)1～15.轉(zhuǎn)基因植株

2.3轉(zhuǎn)基因大白菜Southern檢測(cè)

對(duì)T2代PCR檢測(cè)仍呈陽(yáng)性的植株進(jìn)行了Southern blotting雜交檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明(圖4),PCR檢測(cè)的25個(gè)轉(zhuǎn)化事件中,有19個(gè)轉(zhuǎn)化事件的后代檢測(cè)到雙基因特異性雜交信號(hào)。初步證明外源抗蟲基因已經(jīng)成功整合到了大白菜自交系基因組中。同時(shí),Southern blotting雜交檢測(cè)結(jié)果呈陰性,PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的幾個(gè)轉(zhuǎn)化事件在T3代PCR檢測(cè)也均表現(xiàn)為陰性結(jié)果,再次證明了轉(zhuǎn)化過程中存在少部分假陽(yáng)性事件。而對(duì)Southern blotting雜交檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析表明,用該轉(zhuǎn)化方法對(duì)大白菜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí),大部分轉(zhuǎn)化事件為多拷貝、多位點(diǎn)整合到大白菜基因組中。

A.幾丁質(zhì)酶基因;B.蝎毒基因;P.質(zhì)粒;

2.4轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因大白菜的Elisa檢測(cè)

對(duì)T4代PCR及Southern blotting雜交雙基因均呈陽(yáng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Elisa分析?；趯?dǎo)入的外源基因?yàn)殡p價(jià)抗蟲基因,本研究只對(duì)導(dǎo)入的Chitinase基因進(jìn)行了蛋白表達(dá)濃度測(cè)定。首先,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定chi標(biāo)準(zhǔn)樣品405 nm光吸收值,以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以405 nm光吸收值為縱坐標(biāo),應(yīng)用SigmaPlot軟件制作Elisa檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線[17],相關(guān)性分析表明,標(biāo)準(zhǔn)蛋白相關(guān)系數(shù)為0.992,線性回歸方程為y=0.705x+0.004,之后,利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,分別對(duì)各轉(zhuǎn)化事件后代純合材料和陰性對(duì)照進(jìn)行405 nm光吸收值測(cè)定,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各被檢樣品的Chitinase蛋白濃度,部分結(jié)果如圖5。

檢測(cè)結(jié)果顯示,來源于Z1-5轉(zhuǎn)化事件中的 Z1-5-3株系,外源基因表達(dá)的幾丁質(zhì)酶表達(dá)量最高,鮮葉片含量達(dá)到0.069 μg·g-1。而在轉(zhuǎn)化事件中占大多數(shù)的多拷貝、多整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化株(如表中Z2-3、Z5-1等)在該檢測(cè)中表達(dá)量反而遠(yuǎn)低于單拷貝的轉(zhuǎn)化株系(如Z1-5、Z2-7等),這也與后期蟲試結(jié)果基本吻合。

2.5轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因大白菜抗蟲性網(wǎng)室及田間觀察鑒定

對(duì)所獲得的經(jīng)各代分子檢測(cè)均為陽(yáng)性,嚴(yán)格經(jīng)過蕾期人工授粉所獲得的轉(zhuǎn)基因大白菜自交系T4代進(jìn)行網(wǎng)室及田間抗蟲性觀察鑒定(圖6)。統(tǒng)計(jì)分析顯示(表2),各轉(zhuǎn)化事件T4代植株抗蟲性與對(duì)照相比有顯著差異,其對(duì)小菜蛾及菜青蟲抗性普遍提高2～3級(jí),并且抗蟲性能夠穩(wěn)定遺傳。

從表2可以看到,各轉(zhuǎn)化事件不僅與對(duì)照受體間在抗蟲性方面差異達(dá)5%顯著性水平,其相互之間也存在差異,如Z1-5、Z2-7和其他轉(zhuǎn)化事件如Z9-6、Z19-1等相比,在抗蟲性上也表現(xiàn)出很高的優(yōu)勢(shì)。圖6可以直觀看到部分轉(zhuǎn)基因大白菜與對(duì)照在田間與實(shí)驗(yàn)室人工飼喂的結(jié)果差異顯著。產(chǎn)生這種差異的原因和外源基因的插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)的多少及外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的多少相關(guān)。田間抗性結(jié)果與前期的分子檢測(cè)結(jié)果基本吻合。

圖5　部分轉(zhuǎn)基因大白菜株系目的基因的Elisa檢測(cè)結(jié)果

材料編號(hào)Linenumber小菜蛾各抗性級(jí)別植株比率InsecticidalratiooftransgenicChinesecabbagetodiamondmoth/%0～1級(jí)Level0-13級(jí)Level35級(jí)Level57級(jí)Level7菜青蟲各抗性級(jí)別植株比率InsecticidalratiooftransgenicChinesecabbagetoP.rapaeL./%0～1級(jí)Level0-13級(jí)Level35級(jí)Level57級(jí)Level7Z1-337.29±1.77c38.98±1.18ab20.82±2.25bc1.30±3.42cd60.08±2.45bc29.84±2.58cd9.78±2.08b0±0bZ1-567.33±1.22a20.27±1.30c11.13±3.31d0±0d88.13±1.71a11.68±2.62e0±0c0±0bZ2-321.99±0.40f41.92±2.98ab31.53±2.54b3.57±2.76c50.02±3.53cd35.27±1.75bc13.53±1.71ab0±0bZ2-751.00±0.88b21.55±1.87c24.85±2.28bc0±0d90.52±3.23a9.56±1.43e0±0c0±0bZ5-124.48±0.84ef35.67±0.19ab23.97±3.28bc14.77±2.35b44.65±1.68de40.60±2.47abc12.48±2.00ab0±0bZ6-327.99±0.63de35.99±0.90ab25.95±1.32bc9.36±2.48b43.97±2.32de37.99±0.68abc17.76±2.46ab0±0bZ9-646.89±3.23b34.32±4.63ab17.77±2.36cd0±0d66.04±1.39b31.79±2.51bcd2.00±0.83c0±0bZ11-327.47±0.87e30.96±1.82b45.99±1.14a0±0d49.98±3.04cd39.93±2.43bcd10.26±1.15b0±0bZ19-15.97±0.69g31.96±1.42b59.99±1.41a11.39±3.68b34.95±1.78e51.00±2.07a13.06±2.42ab0±0bZ20-529.38±0.98d44.99±1.45a24.50±2.28bc0±0d53.36±1.68bcd22.10±3.95d15.79±2.27ab0±0bCK4.11±1.84g19.84±2.08c46.97±2.33a23.63±3.84a31.72±3.71e43.98±1.76ab20.23±3.55a3.83±1.75a

注:不同小寫字母表示轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照受體間抗蟲性差異達(dá)到0.05顯著性水平。

Note:The different letters indicate statistic result of insect resistance between the different transgenic lines and control plant at the 0.05 level.

a.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?b～f.部分轉(zhuǎn)基因大白菜:b.z1-5;c.z2-7;d.z19-1;e.z9-6;f.z20-13

3討論

本研究首次實(shí)現(xiàn)了利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法對(duì)大白菜自交系的轉(zhuǎn)化,盡管在所獲得的6 000余粒種子中通過初篩及分子檢測(cè)最終只得到25個(gè)轉(zhuǎn)化事件,轉(zhuǎn)化效率僅為0.4%。但使用該方法不經(jīng)過組織培養(yǎng),當(dāng)代就可以獲得種子,有效地避免了組織培養(yǎng)基因型限制、周期長(zhǎng)等問題,其操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉,不失為一種優(yōu)秀的白菜轉(zhuǎn)化基因方法。在研究過程中也發(fā)現(xiàn),該方法在大白菜所獲得的轉(zhuǎn)化事件中外源基因在宿主基因組中以多拷貝、多位點(diǎn)整合方式存在較多,這與杜建中等[20]在玉米、王景雪等[21]在芥菜等作物上轉(zhuǎn)化結(jié)果不同,在一定程度上降低了其轉(zhuǎn)化效率。在轉(zhuǎn)化過程中也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化事件中存在一定的假陽(yáng)性事件,也存在雙基因只檢測(cè)出一個(gè)基因,而另一個(gè)基因檢測(cè)不到的情況,證明該方法在轉(zhuǎn)化過程中只有部分基因?qū)氲默F(xiàn)象,這可能與前期超聲波處理質(zhì)粒結(jié)構(gòu)破損有關(guān),這與郝曜山等[14]在玉米上結(jié)果是相同的。

本研究所獲得轉(zhuǎn)基因大白菜新品系在溫室及田間的抗蟲性鑒定結(jié)果證明了雙價(jià)抗蟲基因BmkIT-Chitinase編碼的2種殺蟲蛋白對(duì)鱗翅目害蟲有較好的抗性。2種抗蟲基因在大白菜中同時(shí)表達(dá),可以有效地避免該種蔬菜大面積種植時(shí)田間害蟲對(duì)該基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)生抗性及耐受性。鑒于其與商業(yè)上廣泛采用的Bt殺蟲晶體蛋白完全不同的殺蟲機(jī)理,及其專一作用于昆蟲體內(nèi)特殊靶標(biāo)位點(diǎn)而對(duì)哺乳動(dòng)物無害的特性,認(rèn)為對(duì)該新品系的研發(fā)一方面豐富了大白菜的抗蟲基因材料,另一方面也可以有效解決鱗翅目害蟲抗性風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)化事件從T1代到T4代進(jìn)行了PCR、Southern blotting雜交和外源基因表達(dá)的蛋白等分子檢測(cè),并以此結(jié)果為依據(jù)對(duì)大白菜自交系進(jìn)行了選擇,最終獲得了較純合的轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因大白菜新品系。在此過程中,雙價(jià)抗蟲基因BmkIT-Chitinase在大部分材料中能夠隨白菜核DNA穩(wěn)定遺傳,且其蛋白表達(dá)檢測(cè)與田間抗蟲鑒定結(jié)果表現(xiàn)出較高的一致性。但在各代跟蹤檢測(cè)調(diào)查中,也發(fā)現(xiàn)了很多外源基因在各代遺傳中并沒有符合現(xiàn)有的遺傳規(guī)律,如材料z2-1、z5-1等在T2代的PCR檢測(cè)中似乎就表現(xiàn)出很高的純合率,后來的Southern blot雜交檢測(cè)證明了該轉(zhuǎn)化事件中外源基因是以多拷貝的形式存的,結(jié)合該材料的分離情況,我們推測(cè)此事件中外源基因不僅存在多個(gè)拷貝,而且其整位點(diǎn)應(yīng)該處于多條染色體上。研究中還發(fā)現(xiàn)了小部分材料,如Z7-3等,其在T1和T2代材料中PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性,且其陽(yáng)性率較低,而在T3代材料后均檢測(cè)不到陽(yáng)性植株,Southern blotting雜交檢測(cè)結(jié)果為陰性,排除了污染等實(shí)驗(yàn)室人為情況,此假陽(yáng)性事件是如何繼續(xù)到T2代的,推測(cè)是否存在伴隨母體的細(xì)胞質(zhì)遺傳,在這些方面我們將會(huì)進(jìn)一步深入研究。

在轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase基因大白菜遺傳穩(wěn)定的株系中,盡管經(jīng)分子檢測(cè)選擇抗蟲基因已基本純合,其田間抗蟲性與對(duì)照表現(xiàn)出明顯差異,但不同株系間抗蟲性程度也存在明顯差異,研究表明,外源基因的拷貝數(shù)與外源基因的表達(dá)及田間抗蟲性相關(guān)。高拷貝數(shù)基因表達(dá)及田間表現(xiàn)反而低于低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化事件,這與郭美錦等[22]和 Hohenblum H等[23]在畢赤酵母上的外源基因表達(dá)研究結(jié)論是相似的。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),同樣為單拷貝的轉(zhuǎn)化事件在田間抗蟲程度方面也存在較大的差異,這可能和外源基因的插入位點(diǎn)及方式也有一定的相關(guān)性。因此,在選育轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因大白菜新品系時(shí),還結(jié)合了田間調(diào)查,與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合逐代選留了具有較高抗蟲性的單株、自交留種和單株播種方法,最終獲得了5個(gè)轉(zhuǎn)BmkIT-Chitinase雙價(jià)抗蟲基因大白菜優(yōu)良自交系,這些自交系所導(dǎo)入的外源基因可高效表達(dá),在田間抗蟲性表現(xiàn)與對(duì)照有顯著差異,抗性普遍提高了2～3級(jí)。

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(編輯:宋亞珍)

Acquirement of Transgenic Chinese Cabbage withBmkIT-ChitinaseGene and Their Insect -resistant Bioassay

LAN Chuangye1,LIU Zhao1,JIA Xiaojun2,ZHOU Jin2

(1 Shanxi Academy of Agriculture Sciences Vegetables Research Institute,Taiyuan 030031,China;2 Institute of Agricultural Research,6th Branch of XPCG,Wujiaqu,Xinjiang 831300,China)

Abstract:At the present study,the binary insect-resistant BmkIT-Chitinase gene was successfully transformed into the Chinese cabbage inbred line 20-19-3 via pollen mediated transformation approach assisted by supersonic.Five transgenic Chinese cabbage inbred lines Z1-5,Z2-7,Z9-6,Z11-6 and Z20-13 were obtained.The genetic rules,transgenic expression and insect resistance of above transgenic materials were compared with untransformed control.The PCR amplification and Southern blot hybridization detection on transgenic plants and their progeny showed that:(1)BmkIT-Chitinase gene has been transformed into the genome of receptors and the transgenics can inherit stably.Most transgenics exist in multi-copy form and single copy transgenics appeared in few translines.(2)ELISA assay verified the expression of foreign gene and the expression product of BmkIT-Chitinase gene in T4transgenic plants were high to 0.069 μg·g-1fresh leaves.(3)Field insect-resistant bioassay showed that there are significant differences on insect resistance between transformed inbred lines and their control groups.The level of insect resistance activities of Pieris rapae Linnaenus and Plutella xylostella Linnaenus enhanced 2-3 degree.

Key words:Chinese cabbage;pollen mediated transformation;BmkIT gene;Chitinase gene;binary insect-resistant gene

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:蘭創(chuàng)業(yè)(1980-),男,碩士,助理研究員,主要從事大白菜種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。E-mail:1424054138@qq.com

基金項(xiàng)目:科技援疆項(xiàng)目(2014072008)

收稿日期:2015-08-06;修改稿收到日期:2015-12-25

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0008-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0008