王軍旗 張超 馬明瑛

[摘要]目的：探討微血管密度（MVD）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在鼻息肉患者鼻內(nèi)鏡術后囊泡組織中的表達及意義。方法：選取40例慢性鼻息肉患者（80側）為研究對象，實驗組為術后鼻腔刮除的囊泡組織，對照組為術中鼻息肉組織、下鼻甲組織，比較各組MVD和VEGF陽性區(qū)域平均光密度的表達水平，并分析二者在囊泡組織中的相關性。結果：MVD在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次增高，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；VEGF的陽性區(qū)域的平均光密度在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次降低，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；囊泡中MVD與VEGF陽性區(qū)域的平均光密度呈負相關。結論：MVD和VEGF的動態(tài)變化可以作為鼻內(nèi)鏡術后粘膜預后轉歸的監(jiān)測指標。

[關鍵詞]鼻息肉；MVD；VEGF；免疫組化；功能性鼻內(nèi)鏡手術

[中圖分類號]R765.25

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）02-0037-03

慢性鼻鼻竇炎（伴鼻息肉）為鼻部常見病、多發(fā)病，其發(fā)病與多種因素有關，其中血管的形成、細胞因子等在鼻息肉的發(fā)病和形成中發(fā)揮著重要作用。VEGF是己知的最強的血管通透因子，有研究認為鼻粘膜血管通透性增加是導致鼻息肉組織水腫的重要原因，但VEGF在鼻粘膜炎癥調節(jié)過程中的表達、誘生、調控因素等諸方而的研究尚不清楚，鼻息肉術后術腔的囊泡組織是影響患者恢復的重要因素，需在內(nèi)窺鏡下定期清理，才能使術腔完成上皮化過程。雖然現(xiàn)在認為術腔囊泡等的增生是鼻內(nèi)窺鏡術腔轉歸的必經(jīng)階段，但其產(chǎn)生的生物學機制并不清楚。本研究檢測MVD及VEGF的表達，以探討其對鼻息肉術后囊泡組織的MVD及VEGF的表達對鼻腔粘膜上皮化進程的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例及標本：病例選自筆者所在醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2014年3月至8月行鼻內(nèi)鏡手術，術后定期隨訪且有粘膜囊泡、肉芽組織增生的慢性鼻竇炎（雙側，伴鼻息肉）患者40例（80側）其中男23例，女17例，年齡16-72歲，平均38.5歲。全部病例根據(jù)慢性鼻竇炎、鼻息肉診斷和治愈標準（2007 EPOS標準）納入。所有病例統(tǒng)一手術方式及術前術后用藥（口服或靜脈抗生素、糠酸莫米松噴鼻及鼻腔沖洗），均在鼻內(nèi)鏡下?lián)Q藥。術后換藥以術后14周內(nèi)作為研究期限。術后換藥并取鼻腔囊泡組織，同時取12例正常下鼻甲做對照組。

1.1.2 試劑與儀器：鼻內(nèi)鏡手術及監(jiān)視系統(tǒng)采用Storz系統(tǒng)，VEGF鼠抗人單克隆抗體、及二步法免疫組化檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。光鏡及免疫組化攝影采用OLYMPUS BH2型攝影生物顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：分別在留取術中下鼻甲組織、鼻息肉組織以及術后鼻內(nèi)鏡復查時的鼻腔囊泡組織，均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，做成5μm厚切片，行伊紅（HE）染色。

1.2.2

MVD的計數(shù)：選取VEGF染色豐富的區(qū)域，每張切片在400倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)微血管數(shù)目，取平均值。

1.2.3 細胞因子VEGF免疫組織化學檢測：VEGF采用免疫組織化學SP法染色，染色操作步驟按照試劑盒說明書進行，以PBS替代一抗設立陰性對照， 以已知的陽性組織片作為陽性對照。圖像采集利用OLYMPUS BH2型攝影生物顯微鏡，在40倍接物鏡下，選取陽性細胞集中的視野，調整圖像效果，使圖像的背底光密度一致。結果判定：陽性細胞可見棕黃色顆粒定位于細胞質或細胞膜。并采用ImageProPlus6.O軟件進行圖像分析，測量免疫組化切片的陽性而積和積分光密度，通過陽性區(qū)域的平均光密度比較陽性表達的強弱。

1.2.4 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)以x±s表示均數(shù)和標準差，選用SPSS13.O統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗和方差分析；相關性采用Pearson相關分析；P

2 結果

2.1 光鏡下囊泡組織均為假復層纖毛柱狀上皮，一部分組織表現(xiàn)為上皮剝蝕，基底膜不連續(xù)，細胞間隙寬，間質內(nèi)大量紅細胞、大量嗜酸性粒細胞浸潤、固有層水腫，上皮下層嗜酸性粒細胞浸潤（見圖IA）；-部分表現(xiàn)為上皮層完整連續(xù)，上皮層可見杯狀細胞、嗜酸性粒細胞；纖毛柱狀上皮增多，腺體導管內(nèi)及血管周圍可見嗜酸性粒細胞等浸潤（見圖IB）。

2.2 MVD在三組組織中的表達情況，MVD在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次增高，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P

2.3 免疫組化染色結果顯示，VEGF主要定位于囊泡組織基底膜周圍的炎性細胞和上皮細胞以及腺體、血管周圍和血管壁內(nèi)皮細胞（見圖2A、2B）； VEGF的陽性區(qū)域的平均光密度在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次降低，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P

2.4 囊泡組織中MVD與VEGF的相關性分析，MVD與VEGF陽性區(qū)域的平均光密度呈負相關（r=0.575，P

3 討論

VEGF是一種多功能的細胞因子，能高度作用于血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂，其生物學功能為：增加血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞增生，促進淋巴管增生，誘導血管生成。在炎癥、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長等多種病理過程中發(fā)揮著重要的生理或病理作用，特別是在腫瘤新生血管形成中的作用已成為研究熱點。Lee等發(fā)現(xiàn)VEGF是慢性鼻息肉的新型標志物，通過自分泌前饋方式促進鼻粘膜上皮細胞的生長并抑制其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導其遷移并形成管腔樣結構；在體內(nèi)實驗中，它可改變內(nèi)皮細胞表達方式，促進纖維蛋白酶和間質膠原酶的表達，直接誘導新生血管的生長

本實驗結果顯示，囊泡組織的MVD是介于下鼻甲和鼻息肉之間，下鼻甲的MVD最高。Coste A等發(fā)現(xiàn)鼻腔粘膜的血流中鼻甲血流明顯低于下鼻甲，鼻息肉組織及息肉樣變的中鼻甲等的血液供應明顯低于鼻腔余處的粘膜組織，鼻息肉的發(fā)生區(qū)域和鼻腔的血液供應差異明顯相關。這可能從某些角度反應鼻息肉以及息肉樣變經(jīng)常發(fā)生在中鼻甲、中鼻道，而下鼻甲及鼻中隔等很少發(fā)生息肉樣變。在鼻息肉術后術腔恢復過程中囊泡等組織的血液供應明顯改善，術腔粘膜上皮化向良性轉歸。但也有人在鼻息肉形成的動物模型中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育的鼻息肉基質中有大量的血管存在。

與MVD相比，VEGF在下鼻甲組織、囊泡組織以及鼻息肉組織中的表達不盡相同。本實驗結果顯示，VEGF在鼻息肉組織的的表達不局限于血管內(nèi)皮細胞，在一些成纖維細胞以及一些炎性細胞內(nèi)也可以檢測到，囊泡組織中主要定位于囊泡組織的腺體、血管周圍的血管壁內(nèi)皮細胞以及基底膜周圍的炎性細胞和上皮細胞，下鼻甲粘膜上皮微量表達。VEGF在鼻息肉組織中表達最高，囊泡組織次之，下鼻甲組織最低，提示VEGF不僅僅參與鼻息肉的形成，也參與鼻腔正常生理功能的調節(jié)。在人體VEGF以旁分泌的方式特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，通過增加內(nèi)皮細胞內(nèi)囊泡器的功能發(fā)揮對毛細血管和小靜脈的特異性通透作用.這種作用極利于大分子物質外滲，沉積在血管外的基質中，為血管形成過程中多種細胞遷移提供了一個纖維網(wǎng)絡。VEGF還可誘導內(nèi)皮細胞分泌多種組織蛋白酶降解細胞外基質，誘導內(nèi)皮細胞遷移和浸潤、新生血管形成子、基質膠原酶等在內(nèi)皮細胞的表達釋放等以上這些作用可改變細胞外的基質，參與細胞外基質的積聚，使其更易于血管的生長。囊泡組織中的VEGF表達程度可能提示術后的鼻腔粘膜在由鼻息肉向正常鼻腔粘膜轉歸的過程中隨著鼻腔粘膜水腫程度的降低，VEGF的表達程度也隨之減低。由此可以推測通過檢測在術后囊泡等VEGF的表達水平可以判斷術后粘膜預后的轉歸，如果術后的囊泡組織和鼻息肉VEGF表達程度一樣或者更高，則提示鼻息肉復發(fā)的可能。

本實驗結果顯示MVD與VEGF陽性區(qū)域的平均光密度呈負相關，即隨著MVD的增高VEGF的表達程度逐漸降低。雖然很多實驗證明VEGF能引起血管增生，但是并不能說明鼻腔術后囊泡組織VEGF表達越高，囊泡組織的MVD就越高?？赡芏咄瑫r受另一個因素的影響所致。

VEGF可能參與鼻息肉形成的同時也參與正常生理功能的調節(jié)。在不同時期囊泡組織中MVD和VEGF關系，以及囊泡組織中的其他細胞因子對鼻息肉術后粘膜預后轉歸的影響等還需進一步深入探宄。