胡露露 張晉 劉慧 龔忠誠 凌彬 克熱木·阿巴斯 尹小朋 邵博 王冰 林兆全

[摘要]目的：通過檢測口腔頜面部淋巴瘤患者的EBV水平，分析其與臨床病理特征之間的相關(guān)性。方法：選取2014年1月1日至2015年1月1日在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收住的口腔頜面部淋巴瘤患者，采用ISH技術(shù)檢測EBV的水平，從性別、年齡、腫瘤部位、HL淋巴結(jié)內(nèi)外、病灶數(shù)量、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平等方面分析其相關(guān)性。結(jié)果：ISH技術(shù)檢測EBV感染陽性者占45%。與性別、年齡、腫瘤部位、病灶數(shù)量無關(guān)（P>0.05）；與HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)生部位（結(jié)內(nèi)60%，結(jié)外25%，P=O.012）、臨床分期（I+II：30.8%，III+IV：71.4%，P=O.023）、腫瘤分型（NHL：54.9%，HL：11.1%，P=O.017）、病理類型（NKT：84.6%，BCL：23.1%，TCL：20%，HL：11.2%，P=O.034）、LDH水平（LDH>250mmol/l：60%，LDH≤250mmol/1.36%，P=O.026）有關(guān)（P<0.05）；HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平均是頜面部淋巴瘤患者EBV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。結(jié)論：EBV感染在口腔頜面部淋巴瘤患者呈高度陽性表達(dá)，HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平均是頜面部淋巴瘤患者EBV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞]口腔頜面部腫瘤；惡性淋巴瘤；EB病毒；臨床病理特征；相關(guān)性分析

[中圖分類號]

R739.8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1008-6455（2016）02-0024-04

淋巴瘤原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴組織，是一種惡性腫瘤，全身各部位均可發(fā)生。近年來，口腔頜而部淋巴瘤發(fā)病率上升快，占頭頸部腫瘤的3%，占全身淋巴瘤的8%-27%。EB病毒（EPstein-Barr virus，EBV）屬于皰疹病毒亞科，病毒潛伏，易致腫瘤發(fā)生。研究表明，許多腫瘤發(fā)生與EBV感染有關(guān)，如鼻咽癌、何杰金氏病、伯基特淋巴瘤等。本研究通過對在我院收治的40例口腔頜而部淋巴瘤患者進(jìn)行分析，探索口腔頜而部淋巴瘤的臨床病理特征與EBV感染的相關(guān)性，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 一般資料

收集2014年1月1日201 5年1月1日在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜而外科首診的，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為非霍奇金淋巴瘤的病例40例，其中男22例，女18例；年齡24-75歲，平均年齡（52.8±6.4）歲，中位年齡（51.7±5.6）歲，臨床分期：I期：12例，II期：14例，III期：14例，IV期：IO例。

1.2 儀器與試劑

CD20、CD79a、Pax-5. CD15、CD30. CD45Ro.CyclinDI、CD23、CD5、Ki-67、HMB45、S-IOO、CKpan、波形蛋白、CDIO，ALK、CD65、CD56封閉液+一抗，兔抗鼠免疫組化二抗試劑盒，DAB試劑盒，過氧化氫，多聚賴氨酸，0.01%檸檬酸鈉緩沖液；二甲苯，無水乙醇，石蠟，蘇木素，中性樹膠（中國常州山峰化工有限公司）。

超凈工作臺（美國Formal）；普通離心機(jī)（上海飛鴿）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；組織包埋機(jī)（日本SAKURA）；脫水機(jī)（日本TIYODA）；超薄切片機(jī)（德國Leica）；臺式恒溫振蕩器（上海精宏）；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（美國惠普）。

1.3 方法及診斷

入組病例為手術(shù)切除標(biāo)本及活檢標(biāo)本，均行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，由2名高年資病理醫(yī)師閱片。參照WHO（2008版）造血與淋巴組織腫瘤分型。免疫組織化學(xué)采用二步法，包括CD20、CD79a、Pax-5、CD15、CD30、CD45Ro、CyclinDI、CD23、CD5、Ki-67、HMB45、S-IOO、CKpan、波形蛋白、CDIO、ALK、CD65、CD56等。

1.4 ISH檢測

應(yīng)用ISH技術(shù)檢測40例淋巴瘤石蠟包埋組織EBV的感染情況，采用地高辛標(biāo)記的EBER RNA寡核苷酸探針，與EBV編碼的小RNA互補(bǔ)結(jié)合。連續(xù)切片，厚度3-4μm，附于3氨丙基三乙氧硅烷（APEC）處理過的載玻片上。58℃烤片2h，二甲苯脫蠟lOmin，無水乙醇浸泡5min?？諝飧稍铮游傅鞍酌赣?7℃環(huán)境下消化30min，梯度乙醇脫水、空氣干燥。滴加探針，加蓋玻片，37℃孵育過夜。PBS沖洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的地高辛抗體，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。分別使用陽性對照探針與陰性對照應(yīng)用于已知的陽性切片。

1.5 結(jié)果判斷結(jié)果

陽性信號呈紫藍(lán)色，定位于細(xì)胞核，每（20×10）倍視野中陽性細(xì)胞數(shù)≤1%為1分，2%-lO%為2分，11%-50%為3分，大于等于51%為4分。1-4分為陽性，O分為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.O統(tǒng)計(jì)軟件，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與各臨床病理特征關(guān)系的單因素分析采用卡方檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸模型，以P

2 結(jié)果

2.1 頜而部淋巴瘤的臨床病理特征與EBV感染的相關(guān)性

入組的40例頜而部淋巴瘤患者中，出現(xiàn)EBV感染有18例，占45%。從性別、年齡、腫瘤部位、HL淋巴結(jié)內(nèi)外、病灶數(shù)量、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平進(jìn)行比較，性別、年齡、腫瘤部位、病灶數(shù)量各亞組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>O.05）；HL結(jié)內(nèi)占60%，高于結(jié)外，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；臨床分期方而，III+IV期者71.4%，高于I+II期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；腫瘤分型上，NHL占54.9%，HL占11.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；病理分型中，NKT出現(xiàn)EBV感染者占76.9%，BCL占23.1%，TCL占200h，HL占11.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P250mmol/l者占60%，高于LDH≤250mmol/l者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；具體結(jié)果見表1所示。

2.2 頜而部淋巴瘤的臨床病理特征與EBV感染的多因素分析

對HL淋巴結(jié)發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HL淋巴結(jié)發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平均是頜而部淋巴瘤患者EBV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其相對危險(xiǎn)度見表2。

3 討論

惡性淋巴瘤發(fā)生于淋巴細(xì)胞及前體細(xì)胞，首發(fā)癥狀為肉眼可見的，呈局灶性的腫瘤性質(zhì)的腫物。淋巴瘤分兩大類：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，后者占淋巴瘤總數(shù)的80%-90%。EBV主要入侵人體的口腔、鼻咽部淋巴組織，感染B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞，約90%成人血清中可檢測到EBV抗體，EBV隱性感染者可終身攜帶。截至目前的研究發(fā)現(xiàn)，EBV感染與鼻咽癌、淋巴瘤、淋巴組織增生性疾病有關(guān)。然而，EBV感染與淋巴瘤的臨床病理特征是否有相關(guān)性，研究者們?nèi)晕唇?jīng)研究證實(shí)。

在本研究ISH技術(shù)檢測EBV感染情況，出現(xiàn)EBV感染有18例，占45%。男性患者約45.5%出現(xiàn)EBV感染，女性占44.5%，60歲以下有52.2%出現(xiàn)EBV感染，60歲以上占35.3%。有研究者發(fā)現(xiàn)，該病發(fā)病男性患者偏多，年齡2-82歲，男女比例2.4：1?？谇活M而部淋巴瘤發(fā)生于牙齦、腭、頰、頜骨等部位，多為非霍奇金淋巴瘤。本研究中，發(fā)生于腮腺者占62.5%，牙齦區(qū)占71.4%，硬腭占57.1%，下頜骨占50%，在發(fā)病部位上無明顯差異?？谇活M而部淋巴瘤多為淋巴結(jié)外病變，有的表現(xiàn)為無淋巴結(jié)受累，發(fā)生于頜而骨的伯基特淋巴瘤都存在EBV感染。本研究中，NHL占54.9%，明顯高于HL的11.1%，HL結(jié)外者占60%，高于結(jié)內(nèi)，提示HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)病與EBV感染有關(guān)。此外，本研究還從病灶數(shù)目、臨床分期、腫瘤分型、LDH水平等方而進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，單發(fā)病灶占39. 3%，多發(fā)者占58.3%，無明顯差異，III+IV期者71.4%，高于I+II期；NKT出現(xiàn)EBV感染者占76.9%，BCL占23.1%，TCL占20%，HL占11.1%； LDH>250mmol/l者占60%，高于LDH≤250mmol/l者。表明，EBV感染與頜而部淋巴瘤的臨床分期、腫瘤分型、LDH水平具有相關(guān)性。

進(jìn)一步對單因素分析結(jié)果行l(wèi)ogistic多因素分析發(fā)現(xiàn)，HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平均是頜而部淋巴瘤患者EBV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在EBV的作用機(jī)制上，EBV通過gp350結(jié)合CD21，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入被感染細(xì)胞，感染B淋巴細(xì)胞后，DNA自我復(fù)制。在口腔頜而部淋巴瘤中，NHL較HL更多見，約占總數(shù)的5%。EBV與經(jīng)典型HL所有亞型相關(guān)，但EBV感染是NHL的非主要事件，是病因、促發(fā)因素、伴隨因素尚未證實(shí)。Kimura指出，口腔頜而部淋巴瘤與EBV感染有關(guān)的常發(fā)生于淋巴結(jié)外組織?？谇活M而部EBV陽性淋巴瘤以NK/T為主，EBV感染與NK/T細(xì)胞淋巴瘤的生、發(fā)展密切相關(guān)。這均與本研究結(jié)果相近似。

綜上所述，EBV感染在口腔頜而部淋巴瘤患者呈高度陽性表達(dá)，與性別、年齡、腫瘤部位、病灶數(shù)量無關(guān)，HL淋巴結(jié)內(nèi)外發(fā)生部位、臨床分期、腫瘤分型、病理類型、LDH水平均是頜而部淋巴瘤患者EBV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。EBV感染與口腔頜而部淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，為臨床上尋找淋巴瘤新的治療方式提供理論依據(jù)。