單梓梅

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830001

不同方式誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型的骨密度及骨代謝指標的差異

單梓梅

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830001

目的：探討維甲酸、D-半乳糖、苯妥英鈉和糖皮質(zhì)激素4種方式誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)增生模型的骨密度和各項骨代謝生化指標的變化。方法：將50只大鼠隨機分為對照組、維甲酸誘導(dǎo)模型組、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組、苯妥英鈉模型組和糖皮質(zhì)激素模型組，每組10只大鼠。采用相應(yīng)的方式誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)增生，持續(xù)給藥2個月后觀察1個月。檢測5組大鼠的骨密度、血鈣、血磷、骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、甲狀旁腺激素(PTH)、胰島素生長因子-1(IGF-1)等。結(jié)果：股骨骨密度、脛骨骨密度及BGP、IGF-1維甲酸誘導(dǎo)模型組、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組、苯妥英鈉模型組、糖皮質(zhì)激素模型組均低于對照組(P＜0.05)。血鈣及血磷D-半乳糖誘導(dǎo)模型組、苯妥英鈉模型組、糖皮質(zhì)激素模型組低于對照組(P＜0.05)；維甲酸誘導(dǎo)模型組高于對照組(P＜0.05)。ALP甲酸誘導(dǎo)模型組高于對照組(P＜0.05)、BGP、IGF-1維甲酸誘導(dǎo)模型組、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組、苯妥英鈉模型組、糖皮質(zhì)激素模型組低于對照組(P＜0.05)。PTH、TRAP維甲酸誘導(dǎo)模型組、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組、苯妥英鈉模型組、糖皮質(zhì)激素模型組均高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論：維甲酸、D-半乳糖、苯妥英鈉和糖皮質(zhì)激素4種方式誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中，骨密度、BGP、IGF-1、PTH和TRAP表現(xiàn)出了相同的變化趨勢，而血鈣、血磷、ALP的變化趨勢則因誘導(dǎo)方式不同而不同。

骨質(zhì)疏松；大鼠；維甲酸；D-半乳糖；苯妥英鈉；糖皮質(zhì)激素

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下、骨骼微結(jié)構(gòu)組織破壞、骨脆性增加、骨折危險度增加為特征的代謝性疾病。骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為最常見的老年病之一，嚴重危害老年人的健康和生活質(zhì)量［1］。目前全世界骨質(zhì)疏松患者總?cè)藬?shù)約有兩億多人，是位居第六位的常見病、多發(fā)病。骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療已經(jīng)成為迫切需要解決的全球性問題。臨床中要治療骨質(zhì)疏松癥，對其發(fā)病機理的探索是必不可少的，而動物模型是最常用的研究手段［2］。動物模型的構(gòu)建過程中，由于大鼠的骨改建周期短、生長快、易于飼養(yǎng)、成本低、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，所以成為最常見的骨質(zhì)疏松實驗動物模型。目前常用的大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立方法有以下幾種：D-半乳糖致骨質(zhì)疏松模型、去勢模型、維甲酸干預(yù)模型、糖皮質(zhì)激素干預(yù)模型、營養(yǎng)不良模型和廢用模型。骨代謝生化指標是反映骨形成和吸收情況，并存在于血液和尿液中。骨礦物質(zhì)相關(guān)的生化指標包括血鈣、血磷、血鎂、尿鈣、尿磷［3］；骨形成相關(guān)生化指標有骨鈣素(Bone Gla protein，BGP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)等［4］；骨吸收相關(guān)生化指標有抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)等［5］；新一代骨代謝血生化指標有護骨素(Osteoprotegerin，OPG)、瘦素(Leptin)、胰島素生長因子-1 (Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等［6］。檢測骨代謝生化指標在骨病的診斷、評價、治療中有非常重要的作用。本研究分別建立由維甲酸、D-半乳糖、苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)的骨質(zhì)增生大鼠實驗動物模型，并對4種骨質(zhì)疏松大鼠模型骨密度及骨代謝生化指標進行了分析，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 12周齡左右的SPF級SD雌性大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，購于蘭州生物制品研究所有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘) 2012-002。

1.2 試劑 維甲酸、D-半乳糖、苯妥英鈉、甲潑尼龍購于中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司；10%的水合氯醛購于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院；大鼠血清骨鈣素檢測試劑盒購于上海研謹生物科技有限公司；大鼠甲狀旁腺激素ELISA試劑盒購于上海信帆生物科技有限公司；大鼠血清TRAP檢測試劑盒購于卡邁舒上海生物科技有限公司；Rat IGF-1 ELA試劑盒購于美國 Diagnostic Systems Laboratories公司，貨號為DSL-10-2900。

1.3 儀器 雙能X線骨密度儀(美國GE公司)；DX800型全自動生化分析儀(美國Beckman公司)；AL-204型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；M3多功能酶標儀(美國MD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠骨質(zhì)疏松實驗動物模型的建立 選取12周齡左右的SPF級SD雌性大鼠50只，體質(zhì)量(300±20)g，觀察1周，無死亡和精神異常后，隨機分為5組，分別為對照組、維甲酸誘導(dǎo)模型組、D-半乳糖誘導(dǎo)模型、苯妥英鈉模型組和糖皮質(zhì)激素模型組，每組10只，在相同的條件下進行飼養(yǎng)。維甲酸誘導(dǎo)模型組大鼠每天相同時間段用維甲酸100 mg/(kg·d)灌胃，皮下注射2.5 mL生理鹽水；D-半乳糖誘導(dǎo)模型組每天2.5 mL食用油灌胃，皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)；苯妥英鈉模型組，每天60 mg/(kg·d)苯妥英鈉懸濁液灌胃，皮下注射2.5 mL生理鹽水；糖皮質(zhì)激素模型組每天2.5 mL食用油灌胃，皮下注射3.5 mg/(kg·d)的甲潑尼龍；對照組每天用2.5 mL食用油灌胃，皮下注射2.5 mL生理鹽水，持續(xù)上述給藥方式2個月，給藥結(jié)束后繼續(xù)觀察1個月，備用。

1.4.2 雙能X線骨密度檢測儀檢測大鼠的骨密度 將5組大鼠分別取出，用10%水合氯醛按照3 mL/kg的劑量腹腔注射對大鼠進行麻醉，將大鼠俯臥位于掃描平臺上，四肢外展，采用雙能X線骨密度檢測儀自帶的小動物模式測定大鼠的右后肢股骨和脛骨的骨密度值。

1.4.3 大鼠的血鈣、血磷和血清磷酸酶的檢測 測完骨密度的大鼠，在麻醉狀態(tài)下摘除大鼠眼球取血，分離血清并分裝后于-20℃保存待用。用全自動生化分析儀測定血清中的血鈣、血磷和血清磷酸酶水平。

1.4.4 ELISA法檢測血清骨鈣素的含量 在酶標包被板上設(shè)5個標準孔，濃度分別為1.2、0.8、0.4、0.2、0.1 μg/L，每個濃度加兩個復(fù)孔。在酶標板待測樣品孔中加樣品稀釋液40 μL，然后加待測大鼠血清10 μL，重復(fù)2個復(fù)孔。37℃孵育30分鐘后洗5次拍干，每孔加50 μL酶標試劑。37℃孵育30分鐘后洗5次拍干，每孔加顯色劑A50 μL，顯色劑B50 μL，37℃避光顯色10分鐘后，加100 μL終止液，酶標儀OD450讀值。EXCEL作圖計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為大鼠血清骨鈣素的濃度。

1.4.5 大鼠血清甲狀旁腺激素的檢測 用標準品稀釋液將標準品稀釋為 10、5、4、2.5、1.25、0.625 U/mL，用樣品稀釋液將大鼠血清5倍稀釋，取出試劑盒中已包被的ELISA板，分別加入標準品和樣品，每孔50 μL，重復(fù)2個復(fù)孔。37℃孵育30分鐘后洗5次拍干，每孔加入酶標試劑50 μL，37℃孵育30分鐘后洗5次拍干，每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘，酶標儀OD450讀值。EXCEL作圖計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為大鼠血清甲狀旁腺激素的濃度。

1.4.6 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中TRAP的含量 用標準品稀釋液將標準品稀釋為3.6、1.8、0.9、0.45、0.225 ng/mL，用樣品稀釋液將大鼠血清5倍稀釋，將標準品和樣品加入已經(jīng)包被的ELISA板，每個濃度重復(fù)2個復(fù)孔，每孔加50 μL。37℃孵育30分鐘后用洗滌液洗滌5次拍干，每孔加入酶標試劑50 μL，37℃孵育30分鐘后用洗滌液洗滌5次拍干，每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘，加50 μ L終止液，酶標儀OD450讀值。以標準物的濃度為橫坐標，OD450為縱坐標，利用EXCEL繪制標準曲線，得出回歸方程，將樣品的OD450值帶入回歸方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶的濃度。

1.4.7 大鼠血清胰島素樣生長因子-1的檢測

按照試劑盒的說明，確定標準管、樣品管和空白管并做好標記，在標定的各孔分別加入50 μL的樣品、標準品和控制品，接著在標定的各孔內(nèi)分別加入100 μL的大鼠蛋白毒素抗體結(jié)合溶液，再加入100 μL的大鼠IGF-1抗毒血清，500～700 r/min，在搖床上室溫搖動1小時，洗滌液洗滌5次后拍干，加入200 μL的Streptavidin-Enzymeconjugate溶液，500～700 r/min在搖床上室溫搖動1小時，再洗滌5次后拍干，加入100 μL的TMB Chromogen溶液，500～700 r/min在搖床上室溫搖動30分鐘，避免陽光直射，加入100 μL的終止溶液，輕輕搖晃5～10秒，終止反應(yīng)，酶標儀OD450讀值并按照說明書計算結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Origin 8.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用表示，差異性通過t檢驗進行判斷，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度及血鈣、血磷 股骨、脛骨骨密度維甲酸及D-半乳糖誘導(dǎo)模型組，苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素模型組均低于對照組(P＜0.05)。血鈣及血磷D-半乳糖誘導(dǎo)模型組，苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素模型組低于對照組(P＜0.05)，維甲酸誘導(dǎo)模型組高于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1 ALP維甲酸誘導(dǎo)模型組高于對照組(P＜0.05)，D-半乳糖誘導(dǎo)模型組，苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素模型組低于對照組(P＜0.05)；BGP、IGF-1維甲酸、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組，苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素模型組均低于對照組(P＜0.05)；PTH、TRAP維甲酸、D-半乳糖誘導(dǎo)模型組，苯妥英鈉、糖皮質(zhì)激素模型組均高于對照組(P＜0.05)。見表2。

表1 大鼠的右后肢股骨和脛骨的骨密度測量結(jié)果

表1 大鼠的右后肢股骨和脛骨的骨密度測量結(jié)果

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表2 各組ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1比較

表2 各組ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1比較

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3 討論

反映新骨形成的生化指標包括血清堿性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、骨鈣素和Ⅰ型前膠原羥基端的前肽PICP等指標。本實驗中反應(yīng)新骨形成的生化指標測定了血清堿性磷酸酶和血清骨鈣素，一般情況下，骨質(zhì)疏松患者新骨形成減少，骨吸收升高，所以反映新骨形成的血清生化指標活性一般會降低。本研究中通過維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)增生大鼠與對照組相比血清堿性磷酸酶活性顯著上升，而其他3組的活性卻顯著下降。說明維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)增生大鼠骨形成的活躍程度比較高，而其他3組大鼠的骨形成的活性比較低，其原因有以下2個方面：第一是由于維甲酸促進破骨而出現(xiàn)的骨形成代償性增加。第二可能是骨形成和骨吸收都比較活躍，但骨吸收高于骨形成，表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)換型的骨代謝現(xiàn)象［7-8］。

BGP是一種維生素K依賴性的非膠原蛋白質(zhì)，其生理作用尚不完全清楚，但已知與骨的礦化速率有關(guān)。經(jīng)羥基化而成熟的骨鈣素BGP由成骨細胞分泌后大部分沉積在骨基質(zhì)中，小部分進入血液循環(huán)［9］，因此測定血中BGP一方面反映成骨細胞的活性，但更大程度上反映的是骨轉(zhuǎn)換。本實驗中4種方式誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型組BGP較對照組顯著減少，表明骨形成減少。

反映骨吸收的生化指標有尿羥脯氨酸、血漿抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羥賴氨酸糖苷、尿膠原吡啶啉、Ⅰ型膠原羧基N末端肽、降鈣素、甲狀旁腺激素等。本實驗中測定了血清甲狀旁腺激素和血清抗酒石酸酸性磷酸酶，表明骨質(zhì)疏松患者的骨吸收升高，造成骨量減少。實驗結(jié)果顯示4種方式誘導(dǎo)后大鼠血清甲狀旁腺激素和血清抗酒石酸酸性磷酸酶的活性相比于對照組都升高了，說明骨質(zhì)疏松患者骨吸收增強后打破了骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡［10］。

IGF-1是包括成骨細胞在內(nèi)的多種細胞的促有絲分裂劑，而且破骨細胞的增殖和分化也需要IGF-1的參與。IGF-1還可以通過不依賴促有絲分裂的途徑促進骨基質(zhì)的合成和礦化，它以自分泌和旁分泌的形式調(diào)節(jié)骨骼細胞的功能，影響骨代謝［11-12］。它能減少骨膠原退化，增加骨質(zhì)沉淀，促進成骨細胞分化、成熟，刺激骨礦化，促進骨生長。本次實驗中，與對照組相比，4種不同方式誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型組的IGF-1明顯降低，提示IGF-1的減少在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中起了一定的作用。

綜上所述，維甲酸、D-半乳糖、苯妥英鈉和糖皮質(zhì)激素4種方式誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中，骨密度、BGP、IGF-1、PTH和TRAP表現(xiàn)出了相同的變化趨勢，而血鈣、血磷、ALP的變化趨勢則因誘導(dǎo)方式不同而不同。

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Differences in Bone Mineral Density and Bone Metabolism of Rats Model with Osteoporosis Induced by Different Methods

SHAN Zimei
People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi 830001,China

Objective: To explore changes of the bone mineral density(BMD) and bone metabolism of rats model with osteoporosis induced by retinoic acid, D-galactose, phenytoin and glucocorticoids. Methods: All 50 rats were randomly divided into the control group, retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group, each group ten rats. Rats model with osteoporosis was induced by the corresponding methods, given continuous administration two months and observed for one month. BMD, blood calcium, phosphorus, BGP, ALP, TRAP, PTH and IGF-1 of the rats in five groups were detected. Results: Femoral BMD, tibial BMD, BGP and IGF-1 in retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than these of the control group(P＜0.05). Blood calcium and phosphorus in D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than these of the control group(P＜0.05); retinoic acid induced model group were higher than the control group(P＜0.05). ALP formic acid induced model group were higher than the control group(P＜0.05), retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than the control group in BGP and IGF-1(P＜0.05). PTH and TRAP of retinotic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were higher than these of the control group(P＜0.05). Conclusion: In rats model with osteoporosis induced by retinoic acid, D-galactose, phenytoin and glucocorticoids, BMD, BGP, IGF-1, PTH and TRAP manifest the same change trend, while the change trends of blood calcium, phosphorus and ALP are different because of different induction methods.

osteoporosis; rats; retinoic acid; D-galactose; phenytoin; glucocorticoids

R285.5

A

1004-6852(2016)12-0023-04

2016-10-20

單梓梅(1972—)，女，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：骨質(zhì)疏松癥的診治。