呂兆勇,趙春梅,薛仁鎬

(1.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城　252000;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島　266109)

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葡萄逆境脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

呂兆勇1,趙春梅2,薛仁鎬2

(1.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城252000;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島266109)

摘要：為了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表達(dá)特性,采用PCR技術(shù)從葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段長度為1 354 bp的啟動(dòng)子片段,命名為PCAN。采用PlantCARE和PLACE啟動(dòng)子在線預(yù)測工具分析表明,PCAN啟動(dòng)子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的順式作用元件和一些參與非生物脅迫、光和植物激素應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。為驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)特性,將PCAN啟動(dòng)子連接到pCAMBIA1391Z載體GUS基因的上游,構(gòu)建成植物表達(dá)載體p1391Z-CAN,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,經(jīng)PCR鑒定,獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行逆境脅迫處理發(fā)現(xiàn),在干旱處理120 min后,PCAN啟動(dòng)子活性達(dá)到最強(qiáng);而4 ℃低溫處理30~60 min時(shí),PCAN啟動(dòng)子活性達(dá)到最強(qiáng),表明PCAN啟動(dòng)子具有低溫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)特性。

關(guān)鍵詞：葡萄;PCAN啟動(dòng)子;脅迫誘導(dǎo)表達(dá);GUS檢測

植物基因的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,由啟動(dòng)子和與之相互作用的轉(zhuǎn)錄因子共同完成,受到多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用。啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合,并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動(dòng)子按照轉(zhuǎn)錄方式可以分為:組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[1]。植物受到逆境(低溫、高鹽、干旱等)脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng),以降低或消除逆境脅迫給植物帶來的危害。逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以誘導(dǎo)植物在各種不良生長環(huán)境中表達(dá)抗逆基因,使其表現(xiàn)出一定的抗逆性。在逆境脅迫條件下,轉(zhuǎn)錄因子與脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子的順式作用元件結(jié)合,特異地啟動(dòng)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而作出調(diào)節(jié)反應(yīng)。目前,關(guān)于逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有很多報(bào)道,例如Weising等[2]研究發(fā)現(xiàn),Atrd29A基因啟動(dòng)子具有干旱、高鹽及低溫脅迫響應(yīng)的順式作用元件。Kasuga等[3]比較了由CaMV35S組成型啟動(dòng)子和冷誘導(dǎo)rd29A啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)CBF基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的低溫抗性和生長狀況,發(fā)現(xiàn)由rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)CBF基因植株比由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株所表現(xiàn)出來的生長延滯要輕微的多。Roychoudhury等[4]將水稻的Rab16A基因轉(zhuǎn)化到煙草中,并由Rab16A基因啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng),然而研究發(fā)現(xiàn)Rab16A基因只有在高鹽脅迫條件下才會(huì)表達(dá),且植株的生長狀態(tài)正常,表現(xiàn)出明顯的耐鹽能力,表明Rab16A基因啟動(dòng)子是鹽脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Manavella等[5]對(duì)向日葵HAHB4啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn),在HAHB4啟動(dòng)子上含有ABRE元件。對(duì)轉(zhuǎn)HAHB4基因的擬南芥和向日葵進(jìn)行GUS染色和RT-PCR分析,結(jié)果顯示ABRE元件對(duì)ABA、NaCl和干旱脅迫做出反應(yīng)。在脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)多種與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子,如DRE元件及DREB類轉(zhuǎn)錄因子、MYB元件及MYB類轉(zhuǎn)錄因子、GT-1元件及GT-1類轉(zhuǎn)錄因子等[6-8]。

本研究從葡萄(VitisviniferaL.)中克隆了1個(gè)逆境相關(guān)的基因(登錄號(hào):CAN70200.1),為明確該基因的表達(dá)特性,依據(jù)葡萄基因組序列,克隆了該基因的啟動(dòng)子片段,分析了啟動(dòng)子序列中含有的順式作用元件,并構(gòu)建該啟動(dòng)子的融合GUS基因的植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得轉(zhuǎn)基因植株,并對(duì)其進(jìn)行逆境脅迫處理,分析其在煙草各組織中的表達(dá)特性,為揭示該基因在葡萄生長發(fā)育及非生物逆境應(yīng)答中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料與試劑

植物材料:葡萄幼苗由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。

載體與試劑:大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞與載體pCAMBIA1391Z由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室保存提供;DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體和植物基因組DNA提取試劑盒購于TaKaRa(大連)公司;各種生化試劑購置于上海生工生物工程有限公司。

1.2葡萄幼葉基因組DNA的提取

參照植物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書提取葡萄新鮮幼葉的基因組DNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.3PCAN啟動(dòng)子克隆

根據(jù)目的基因的上游啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物VvESTPF (5′-ACACTCGTCCCATCTCCCATC-3′),VvESTPR (5′-TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC-3′),以提取的葡萄幼葉DNA為模板,使用TaKaRaTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,按照說明書中的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收后克隆到pMD19-T載體(TaKaRa公司),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,重組質(zhì)粒命名為pMD19T-CAN,陽性克隆送往TaKaRa(大連)公司測序。

1.4PCAN啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE網(wǎng)站[9](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE[10](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在線分析啟動(dòng)子區(qū)域存在的啟動(dòng)子順式調(diào)控元件。

1.5植物表達(dá)載體p1391Z-CAN的構(gòu)建及鑒定

將連接順序正確重組質(zhì)粒pMD19T-CAN用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切切下目的片段,同樣用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切表達(dá)載體pCAMBIA1391Z,在T4DNA連接酶作用下連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂布含Kan(50 μg/mL)的固體LB平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。在平板上挑取單菌落,接種含Kan(50 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切驗(yàn)證,將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為p1391Z-CAN。

1.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

用凍融法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105,采用葉盤法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將切割的煙草葉片預(yù)培養(yǎng)2 d后,置于含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105侵染液中浸泡15 min左右,期間不停輕輕搖晃,使葉盤切面充分接觸菌液。取出葉盤,用無菌濾紙吸去多余菌液,將葉盤置于預(yù)培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d,然后將上述預(yù)培養(yǎng)葉片轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d左右后,轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待分化的抗性不定芽長出達(dá)1 cm時(shí),將其切下轉(zhuǎn)入MS含有潮霉素(Hygromycin,Hyg)10 mg/L和羧芐青霉素(Carbenicillin,Carb)250 mg/L的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性植株生根篩選。

1.7轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA,利用根據(jù)GUS基因設(shè)計(jì)的引物GUSR(5′-TTACAGAACCGACGACTCG-3′)和GUSR(5′-TAGTGCCTTGTCCAGTTGC-3′)擴(kuò)增706 bp的片段。

1.8轉(zhuǎn)基因煙草的逆境脅迫處理

抗性苗T0種子萌發(fā)成苗后,做逆境脅迫處理。低溫處理:將轉(zhuǎn)基因煙草幼苗放在4 ℃低溫分別處理0，1，2，5，10，30，60，240 min,取其葉片進(jìn)行GUS染色。干旱處理:將轉(zhuǎn)基因幼苗葉片放在室溫25 ℃下分別處理0,15,30,60,120 min,然后進(jìn)行GUS染色。

2結(jié)果與分析

2.1PCAN啟動(dòng)子序列克隆

利用PCR方法從葡萄幼葉基因組DNA中擴(kuò)增PCAN啟動(dòng)子(圖1),測序結(jié)果表明,該啟動(dòng)子大小為1 354 bp,經(jīng)序列同源性比對(duì)表明,該P(yáng)CAN啟動(dòng)子序列與網(wǎng)站上的序列同源性達(dá)到96%(圖2)。

2.2PCAN啟動(dòng)子序列分析

利用PlantCARE和PLACE網(wǎng)站在線分析啟動(dòng)子區(qū)域存在可能的順式作用元件,分析發(fā)現(xiàn)PCAN啟動(dòng)子含有TATA-box、CAAT-box序列和提高轉(zhuǎn)錄水平元件5′UTR Py-rich stretch。PCAN啟動(dòng)子含有參與逆境脅迫調(diào)控元件,例如熱激應(yīng)答元件HSE、厭氧誘導(dǎo)所需的元件ARE、參與干旱應(yīng)答的元件MYCR、低溫應(yīng)答元件LTR、傷害應(yīng)答元件WUN-motif、赤霉素應(yīng)答元件MYB。啟動(dòng)子區(qū)還含有胚乳表達(dá)所需元件Skn-1-motif、晝夜節(jié)律控制元件Circadian。此外,在PCAN啟動(dòng)子還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)光應(yīng)答元件,包括ACE、AT1-motif、Box Ⅰ、G-box、GAG-motif、GT1-motif、SP1、TCT-motif(表1、圖2)。

Marker.DL10000 Marker;1.PCR產(chǎn)物。

順式作用元件Cis-actingregulatory核心序列Coresequence功能 Function 數(shù)目Number5'UTRPy-richstretchTTTCTTCTCT提高轉(zhuǎn)錄水平元件3ACEAAAACGTTTA光應(yīng)答元件1ARETGGTTT厭氧誘導(dǎo)所需元件2AT1-motifATTAATTTTA-CA部分光應(yīng)答元件2ATGCAAATmotifATACAAATTGAGTCA位點(diǎn)相關(guān)元件1Box4ATTAAT部分保守DNA光應(yīng)答元件3BoxⅠTTTCAAA光應(yīng)答元件4Box-W1TTGACC真菌激活子應(yīng)答元件1CAAT-boxCAAT啟動(dòng)子和增強(qiáng)子普遍存在的元件10CAT-boxGCCACT分生組織表達(dá)相關(guān)的元件1EREATTTCAAA乙烯應(yīng)答元件1G-boxGACGAC光應(yīng)答元件1GAG-motifGGAGATG部分光應(yīng)答元件1GT1-motifGGTTAA光應(yīng)答元件1HSEAAAAAATTTC熱激應(yīng)答元件1LTRCCGAAA低溫應(yīng)答元件1Skn-1-motifGTCAT胚乳表達(dá)所需元件1SP1CC(G/A)CCC光應(yīng)答元件1TATA-boxTATAAAT距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)30個(gè)堿基的啟動(dòng)子中心元件17TCA-elementGAGAAGAATA水楊酸應(yīng)答元件1TCT-motifTCTTAC部分光應(yīng)答元件1WUN-motifAAATTTCCT傷害應(yīng)答元件1as-2-boxGATAATGATG莖特異性表達(dá)和光應(yīng)答元件1CircadianCAANNNATC晝夜節(jié)律控制元件1MYCRCANNTG干旱應(yīng)答元件5MYBTAACAAA赤霉素應(yīng)答元件1

圖2　PCAN啟動(dòng)子序列

2.3PCAN啟動(dòng)子融合GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒pMD19T-CAN用EcoR Ⅰ和PstⅠ雙酶切獲得目的片段,同時(shí)將表達(dá)載體pCAMBIA1391Z也用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切,將目的片段和載體膠回收后,根據(jù)濃度確定最合適的連接體系,目的片段連接到載體上后,經(jīng)雙酶切鑒定,在重組質(zhì)粒雙酶切約1 400 bp的PCAN啟動(dòng)子片段(圖3),雙酶切結(jié)果和預(yù)期目的條帶大小一致,說明獲得了PCAN啟動(dòng)子融合GUS表達(dá)載體p1391Z-CAN。

2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,農(nóng)桿菌侵染后,經(jīng)共培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3 d(圖4-A),轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基進(jìn)行抗性芽的篩選(圖4-B),具有抗性的芽生長旺盛(圖4-C),待抗性芽生長到2 cm時(shí)(圖4-D),將抗性芽切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基,使其生根(圖4-E),最后轉(zhuǎn)至花盆中,進(jìn)行室溫培養(yǎng)即煉苗(圖4-F),獲得抗性苗。

2.5PCAN啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定

抗性苗T0種子萌發(fā)成苗后,取煙草抗性苗的幼葉,提取基因組DNA,根據(jù)設(shè)計(jì)的GUS基因的引物,利用PCR檢測。部分轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)果如圖5所示,表明PCAN啟動(dòng)子已經(jīng)轉(zhuǎn)入這些植株。

Marker.DL12000 bp Marker;1.重組

A.共培養(yǎng);B.抗性芽篩選;C.抗性芽;D.抗性芽約2 cm;E.生根;F.抗性苗的馴化。

Marker.DL2000 bp Marker;1~4.抗性苗;5.未轉(zhuǎn)基因的煙草(對(duì)照)。

2.6轉(zhuǎn)基因植株逆境脅迫處理

為了檢測逆境條件下PCAN啟動(dòng)子的表達(dá)特性,在低溫、高溫、鹽、干旱脅迫處理?xiàng)l件下,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的GUS表達(dá)進(jìn)行了檢測。取鑒定陽性的T0轉(zhuǎn)基因煙草的幼葉,對(duì)其4 ℃低溫處理設(shè)置時(shí)間1~240 min,進(jìn)行GUS組織染色,結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照處理和轉(zhuǎn)基因植株未處理的都沒有被染色,而轉(zhuǎn)基因植株在低溫處理1 min時(shí)就已開始表達(dá),10 min時(shí)表達(dá)很高,30~60 min時(shí),表達(dá)最高,240 min后開始有所減弱,說明PCAN啟動(dòng)子是受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)(圖6-A)。將T0轉(zhuǎn)基因煙草幼葉取下,在室溫25 ℃下分別放置15,30,60,120 min。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因未處理的對(duì)照,沒有檢測到GUS表達(dá),而干旱處理15 min時(shí)有微弱表達(dá),在處理120 min時(shí),葉片染色最深(圖6-B),說明PCAN啟動(dòng)子是受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在高溫和鹽脅迫下,未檢測到GUS基因表達(dá)。

A.4 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)處理;B.干旱脅迫誘導(dǎo)處理。

3討論

目前已經(jīng)鑒定出的植物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有多種,主要分為干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和植物激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等[11]。每一種誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子都有一些核心順式作用元件。例如GCC-box是乙烯應(yīng)答元件,存在于許多PR基因啟動(dòng)子區(qū)域,在植物抗性反應(yīng)和生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用,TAGAAGCCGCC、AGCCGCC是GCC-box的核心序列[12]。G-box最早是Giuliano等[13]在研究光調(diào)控元件時(shí)發(fā)現(xiàn)的,是廣泛存在于植物中的順式作用元件,其共有序列為[C/G/T]ACGTGG[C/G],核心序列為CACGTG。目前已經(jīng)研究得到許多植物非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子順式作用元件,對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能有了一定的認(rèn)識(shí)。本研究所克隆的PCAN啟動(dòng)子經(jīng)分析也發(fā)現(xiàn)了很多順式作用元件,包括低溫應(yīng)答元件LTR、干旱應(yīng)答元件MYCR、赤霉素應(yīng)答元件MYB、熱激應(yīng)答元件HSE、厭氧誘導(dǎo)所需的元件ARE、傷害應(yīng)答元件WUN-motif、光應(yīng)答元件ACE等誘導(dǎo)調(diào)控元件[14-16],胚乳組織表達(dá)元件Skn-1-motif[17],以及與微生物誘導(dǎo)相關(guān)的調(diào)控元件Box-W1[18]等,這些順式作用元件的存在暗示PCAN的啟動(dòng)子可能不僅響應(yīng)非生物脅迫,同時(shí)也可能是一個(gè)生物脅迫誘導(dǎo)的特異啟動(dòng)子,能夠用于葡萄抗病的分子育種中,但這一推測還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。為了明確PCAN啟動(dòng)子的表達(dá)特性,將該啟動(dòng)子與GUS基因相連,構(gòu)建成植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行表達(dá)分析表明,PCAN啟動(dòng)子能夠應(yīng)答低溫和干旱脅迫處理,但不能被高溫和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在低溫處理?xiàng)l件下,該啟動(dòng)子表達(dá)非常迅速,僅在處理1 min時(shí)就已開始表達(dá),在處理10 min時(shí),表達(dá)量迅速增加,之后表達(dá)量一直保存較高水平,表明該啟動(dòng)子具有低溫高效誘導(dǎo)表達(dá)特性;同時(shí),干旱脅迫處理結(jié)果表明,該啟動(dòng)子也具有干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)特性,證實(shí)了PCAN啟動(dòng)子在煙草中能被干旱和低溫逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用,在分子水平上調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的抗性[19-23]。本研究通過網(wǎng)站預(yù)測在PCAN啟動(dòng)子上找到了與逆境脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件,為下一步探索與這些元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子,在轉(zhuǎn)錄水平上弄清PCAN在逆境脅迫誘導(dǎo)下的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯芳,涂慧珍.真核啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā),2015,29(2):7-12.

[2]Weising K,Kahl G.Toward an understanding of plant gene regulation:the action of nuclear factors[J].Zeitschrift für Naturforschung.C,Journal of biosciences,1991,46(1/2):1-11.

[3]Kasuga M,Miura S,Shinozaki K,et al.A combination of theArabidopsisDREB1Agene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer[J].Plant & Cell Physiology,2004,45(3):346-350.

[4]Roychoudhury A,Roy C,Sengupta D N.Transgenic tobacco plants overexpressing the heterologous lea geneRab16Afrom rice during high salt and water deficit display enhanced tolerance to salinity stress[J].Plant Cell Reports,2007,26(10):1839-1859.

[5]Manavella P A,Dezar C A,Ariel F D,et al.Two ABREs,two redundant root-specific and one W-box cis-acting elements are functional in the sunflower HAHB4 promoter[J].Plant Physiology and Biochemistry,2008,46(10):860-867.

[6]張龍,黃真池,歐陽樂君,等.植物人工啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,30(6):150-153.

[7]文添龍,劉雪梅,冀亞萍,等.高等植物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(1):206-214.

[8]李娜,李莉,陳光暉,等.作物抗旱機(jī)理及其相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào),2011,8(3):239-243.

[9]Lescot M,Déhais P,Thijs G,et al.PlantCARE,a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J].Nucleic Acids Research,2002,30(1):325-327.

[10]Higo K,Ugawa Y,Iwamoto M,et al.Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database:1999[J].Nucleic Acids Research,1999,27(1):297-300.

[11]王志新,趙琳,李文濱.植物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].大豆科技,2011(3):5-9.

[12]Eyal Y,Meller Y,Lev-Yadun S,et al.A basic-type PR-1 promoter directs ethylene responsiveness,vascular and abscission zone-specific expression[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,1993,4(2):225-234.

[13]Giuliano G,Pichersky E,Malik V S,et al.An evolutionarily conserved protein binding sequence upstream of a plant light-regulated gene[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1988,85(19):7089-7093.

[14]Barros M D,Czarnecka E,Gurley W B.Mutational analysis of a plant heat shock element[J].Plant Molecular Biology,1992,19(4):665-675.

[15]Baker S S,Wilhelm K S,Thomashow M F.The 5′-region ofArabidopsisthalianacor15a has cis-acting elements that confer cold-,drought-and ABA-regulated gene expression[J].Plant Molecular Biology,1994,24(5):701-713.

[16]Millar A J,Kay S A.Integration of circadian and phototransduction pathways in the network controlling CAB gene transcription inArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1996,93(26):15491-15496.

[17]雒雅婧,李杰,張爽,等.植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J].北方園藝,2015,22:186-189.

[18]Dubos C,Kelemen Z,Sebastian A,et al.Integrating bioinformatic resources to predict transcription factors interacting with cis-sequences conserved in o-regulated genes [J].Bmc Genomics,2014,15(2):1-17.

[19]郭晉艷,鄭曉瑜,鄒翠霞,等.植物非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子順式元件及轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,30(4):16-20,30.

[20]劉輝,王濤濤,張俊紅,等.番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAC80的克隆及表達(dá)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2015,30(1):77-83.

[21]徐佳寧,徐艷群,嚴(yán)振,等.番茄對(duì)非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,47(12):120-124.

[22]劉曉敏,張莉弘,劉金亮,等.玉米逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,3(3):86-90.

[23]齊恩芳,賈曉霞,馬勝,等.擬南芥誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A的克隆及其功能鑒定[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2015,24(4):286-290.

Cloning and Expression Analysis of Grape′s Stress Inducible Promoter

Lü Zhaoyong1,ZHAO Chunmei2,XUE Rengao2

(1.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng252000,China;2.College of Life Sciences,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

Abstract：To study the expression of grape stress tolerance gene (CAN70200.1),a 1 354 bp promoter fragment (named as PCAN) upstream of the gene CAN70200.1 was isolated by using PCR technology.Promoter sequence was analyzed by the database of PlantCARE and PLACE.The result showed that the PCANsequence contained basic elements CAAT-box,TATA-box and some cis-acting elements that response to abiotic stresses,light and plant hormones.To verify the expression pattern of the promoter,the PCANfragment was fused with GUS reporter gene located on pCAMBIA1391Z to construct a plant expression vector p1391Z-CAN,followed by transformation into tobacco by Agrobacterium-meditated method.The expression activity of PCANpromoter reached highest at 120 min after drought stress treatment or at 30-60 min under 4 ℃ cold treatment condition,indicated that the PCANpromoter could express under the condition of treatments with cold and drought.

Key words:Grape;PCANpromoter;Stress induction expression;GUS assay

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.013

中圖分類號(hào)：Q78;S565.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)01-0077-06

作者簡介：呂兆勇(1986-),男,山東聊城人,在讀碩士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。通訊作者：薛仁鎬(1965-),男,吉林汪清人,教授,博士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08010002-003-002);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CM025)

收稿日期：2015-10-10