吐遜.吾守爾（新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆　阿瓦提　843200）

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牛卵母細(xì)胞體外成熟減數(shù)分裂進(jìn)程及核型變化的研究

吐遜.吾守爾（新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆阿瓦提843200）

摘要：為了更加深入了解牛卵母細(xì)胞體外成熟減數(shù)分裂及其伴隨該進(jìn)程中核型的變化，實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的牛卵母細(xì)胞體外成熟方法及核型染色方法對(duì)成熟過(guò)程中減數(shù)分裂恢復(fù)情況及其對(duì)應(yīng)的核型進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：牛卵母細(xì)胞體外成熟8 h減數(shù)分裂抑制恢復(fù)率達(dá)45.26%，成熟12 h時(shí)絕大部分卵母細(xì)胞（81.63%）已經(jīng)恢復(fù)了減數(shù)分裂抑制狀態(tài)，正常成熟24 h后GVBD率達(dá)91.67%。說(shuō)明在對(duì)牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟過(guò)程中卵母細(xì)胞可以按照正常的減數(shù)分裂進(jìn)程發(fā)育至受精前階段，經(jīng)染色后可以較為清楚識(shí)別減數(shù)分裂各時(shí)期細(xì)胞核核型形態(tài)及其變化規(guī)律，為研究牛卵母細(xì)胞體外成熟減數(shù)分裂抑制恢復(fù)的分子機(jī)制探討及體外成熟效率的提高提供了參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：牛卵母細(xì)胞；體外成熟；減數(shù)分裂；核型

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.01.005

體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)（IVP）是集體外受精技術(shù)（IVF）、體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)（IVC）和體外胚胎移植技術(shù)（ET）于一體的體外快速生產(chǎn)胚胎的生物技術(shù)，也稱輔助生殖技術(shù)（ART）。其技術(shù)流程主要包括：卵母細(xì)胞采集，卵母細(xì)胞體外成熟、卵母細(xì)胞體外受精、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植[1]。家畜卵母細(xì)胞體外成熟（In Vitro Maturation,IVM），是體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，理想的體外成熟體系可以使卵母細(xì)胞獲得充分的受精和發(fā)育能力，進(jìn)而提高胚胎體外生產(chǎn)效率[2.3]。減數(shù)分裂是配子形成過(guò)程中生殖細(xì)胞的一種獨(dú)特的分裂方式。雌性哺乳動(dòng)物出生前后，卵原細(xì)胞停止增殖，之后，經(jīng)細(xì)線期、偶線期、粗線期發(fā)育到雙線期，其中雙線期染色質(zhì)高度疏松，具有完整的細(xì)胞核膜，又稱為核網(wǎng)期，即生發(fā)泡（Germinal Vesicle，GV）[4.5]。卵母細(xì)胞將在這一時(shí)期休止時(shí)間不同物種存在顯著差異，數(shù)日至數(shù)年不等。將體內(nèi)卵母細(xì)胞移至體外培養(yǎng)環(huán)境中其會(huì)發(fā)生自發(fā)的減數(shù)分裂恢復(fù)現(xiàn)象，而伴隨這一現(xiàn)象的是細(xì)胞核核相的一系列變化，生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown,GVBD）是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制恢復(fù)的標(biāo)志。故體外成熟過(guò)程中卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂是一個(gè)重要的生理學(xué)事件，因此研究牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中減數(shù)分裂進(jìn)程以及相應(yīng)的核相變化對(duì)于理解配子發(fā)生分子機(jī)制及提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量和胚胎體外生產(chǎn)效率有重大理論意義。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑

恒溫水浴鍋，超凈工作臺(tái)，自動(dòng)滅菌鍋，高速冷凍離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱，屠宰場(chǎng)來(lái)源牛卵巢，20 mL醫(yī)用注射器，體視顯微鏡，熒光顯微鏡，洗卵液TCM199（含有hepes），成熟液基礎(chǔ)培養(yǎng)基TCM199，雙抗，DAPI，PBS等

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑配制

吸卵液：含有Hepes的TCM199 + 2% FBS + 1% (Antibiotic-Antimycotic)+ 50 mg/mL肝素鈉；成熟培養(yǎng)基：TCM199+10 ug/mL FSH+ 10 ug/mlLH+ 1 ug/mlE2+ 10% FBS+1%雙抗+100 uM半胱氨酸。

1.2.2卵母細(xì)胞采集

屠宰場(chǎng)收集牛卵巢，置于30℃～35℃的生理鹽水，（4～5）h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水洗三遍，使用針刺破卵泡，放出壁層顆粒細(xì)胞和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，采用18 g針頭的注射器抽取卵巢表面（3～8）mm直徑大小的卵泡內(nèi)容物，將所采集的卵泡液置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿內(nèi)。采卵完畢后，在體式顯微鏡下挑選A級(jí)(胞質(zhì)均勻帶有數(shù)層致密卵丘細(xì)胞)、B級(jí)(胞質(zhì)均勻帶有數(shù)層較疏松的卵丘細(xì)胞及部分裸露)卵母細(xì)胞[6]。

1.2.3卵母細(xì)胞體外成熟

將挑選出的A級(jí)和B級(jí)COCs在洗卵液及成熟液中分別洗滌3次，然后放入預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h以上的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)（四孔板培養(yǎng)，500 uL體積成熟液，50枚左右卵母）培養(yǎng)條件為含5% CO2的空氣，溫度39℃，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為24 h[7]。

1.2.4卵母細(xì)胞核型鑒定

卵母細(xì)胞在體外成熟不同時(shí)間點(diǎn)采集后，利用口吸管吸出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體置入0.1%的透明質(zhì)酸酶中培養(yǎng)箱內(nèi)處理5 min；使用移液槍反復(fù)輕輕吹打，然后在洗卵液中洗滌并分離卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞，將透明帶上無(wú)顆粒細(xì)胞的裸卵洗靜放入4%的多聚甲醛室溫固定（2～4）h；固定后在PBS中洗滌3次置入0.5%的triton處理30 min；然后口吸管吸出卵母細(xì)胞放到載玻片上滴加1.5 uLDAPI染色后蓋上蓋玻片，在黑暗條件熒光顯微鏡檢測(cè)卵母細(xì)胞核處于GV階段及GVBD的比例[8.9]。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程

將體外成熟不同時(shí)間點(diǎn)卵母細(xì)胞經(jīng)固定，染色后統(tǒng)計(jì)GVBD比率。

表1　牛卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)程

表1說(shuō)明牛卵母細(xì)胞體外成熟8 h減數(shù)分裂抑制恢復(fù)率達(dá)45.26%，成熟12 h時(shí)絕大部分卵母細(xì)胞（81.63%）已經(jīng)恢復(fù)了減數(shù)分裂抑制狀態(tài)，正常成熟24 h后GVBD率達(dá)91.67%。

2.2牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中核型鑒定

圖1　牛卵母細(xì)胞體外成熟減數(shù)分裂各時(shí)期核型

圖1顯示了牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程總減數(shù)分裂進(jìn)程各個(gè)時(shí)期典型的細(xì)胞核核型，GV期細(xì)胞質(zhì)呈纖維狀彌散狀態(tài)分布于細(xì)胞核內(nèi)，隨著GVBD的發(fā)生細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生凝集，最終形成高度致密化的染色體形態(tài)，隨著MI期的到來(lái)，凝集的染色體被紡錘體牽引到赤道板上，第一次減數(shù)分裂后期（anaphase），染色體發(fā)生分離，MII期是極體部分染色體被排出到卵母細(xì)胞外，伴隨著卵母細(xì)胞內(nèi)染色體又重新排列在赤道板上。

3　結(jié)　論

在對(duì)牛卵母細(xì)胞正常體外成熟過(guò)程中統(tǒng)計(jì)了不同時(shí)期GVBD發(fā)生率，并對(duì)減數(shù)分裂不同時(shí)期的典型核型進(jìn)行了鑒定，體外成熟24 h后，牛卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率達(dá)91.67±3.4%，這與李青洋[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的對(duì)照組一致。各個(gè)時(shí)期均可以清楚的觀察到典型的細(xì)胞核型，進(jìn)一步深入了解了牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中減數(shù)分裂抑制恢復(fù)的進(jìn)程，為今后相關(guān)工作奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文章：

[1]Moreno D,Neira A,Dubreil L,.In vitro bovine embryo production in a synthetic medium [J].Embryo development,cryosurvival,and establishment of pregnancy.THERIOGENOLOGY 2015,(84)：1053-60.

[2] Gilchrist RB, Thompson JG. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro[J].THERIOGENOLOGY 2007,(67):6-15.

[3]Sauerbrun-Cutler MT,Vega M,Keltz M,McGovern PG.In vitromaturation and its role in clinical assisted reproductive technology[J].OBSTET GYNECOL SURV 2015,(70):45-57.

[4]孫巖.TBP在減數(shù)分裂和胚胎早期發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)變化[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2007,48.

[5]張杰.大鼠卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中GV染色質(zhì)構(gòu)型的變化[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008,

[6]滑志民.影響山羊活體采卵與體外受精效果的研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007:57.

[7]趙紅衛(wèi).HA對(duì)牛卵母細(xì)胞IVM、早期胚胎IVC及冷凍保存影響的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2004:72.

[8]Karja NW ,Otoi T,MurakamiM,Fahrudin M,Suzuki T.In vitromaturation,fertilization and development of domestic cat oocytes recovered from ovaries collected at three stages of the reproductive cycle[J]. THERIOGENOLOGY 2002；（57）:2289-98.

[9] Martins LR,Fernandes CB,Minto BW ,Landim-Alvarenga FC,Lopes MD.Ultrastructural characteristics of non-matured and in vitromatured oocytes collected from pre-pubertal and adult domestic cat ovaries[J]. REPROD DOMEST ANIM 2009，44 Suppl（2）:251-4.

[10]李青洋.減數(shù)分裂抑制劑對(duì)水牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)及胚胎發(fā)育的影響[D].西寧：廣西大學(xué), 2012，72.

Research on the Bovine Oocyte Meiosis in-vitro Maturation and Karyotype Changes

TUXUN.Wushouer
（Xinjiang Awat County Livestock Improvement Station，Awat Xinjiang 843200，China）

Abstract:To further understand the bovine oocyte meiosis in-vitro maturation and karyotype changes along with the process,this paper studies the recovery status of meiosis in the process of maturation and the corresponding karyotype by the regularmethod of bovine oocyte in-vitro maturation and karyotype analysis.It is showed that the recovery rate ofmeiosis reaches 45.26% when bovine oocyte matures in vitro for 8 hours, while the rate reaches to 81.63% and 91.67% for 12 hours and 24 hours respectively,which demonstates that oocytes can grow and reach to the status prior to fertilization with normalmeiosis process during the period of in-vitro maturation of bovine oocytes,and that the form of cellula karyotype and its rules in all period of meiosis can be identified clearly when the oocytes are dyed,which provides reference for the study of molecular mechanisms of bovine oocyte meiosis maturation and the improvement of efficiency of in-vitro maturation.

Key words:bovine oocytes；in-vitromaturation；meiosis；karyotype

收稿日期：2015-10-20，修回日期：2016-01-13

作者簡(jiǎn)介：吐遜.吾守爾（1964—）男，在職碩士，高級(jí)畜牧師，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究工作。

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五”肉牛產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目。

中圖分類號(hào)：S814

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-6377（2016）01-0019-04