王兆華，紀(jì)義波，張大軍.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 300；.吉林省醫(yī)療器械研究所，吉林 長(zhǎng)春 3006

?

三七活血片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王兆華1，紀(jì)義波2，張大軍1
1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.吉林省醫(yī)療器械研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062

摘要：目的建立三七活血片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)制劑中的三七、血竭進(jìn)行鑒別。采用高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量，色譜柱為Shim-pack（島津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果三七、血竭的薄層色譜特征斑點(diǎn)分離清晰，陰性無(wú)干擾。芍藥苷在0.269 6～1.348 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r＝0.999 8）；供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.68%，RSD＝0.78%（n＝6）。結(jié)論本研究所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于控制三七活血片的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：三七活血片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；三七；血竭；薄層色譜法；高效液相色譜法；芍藥苷

三七活血片是在吉林省中醫(yī)院院內(nèi)制劑三七活血膠囊基礎(chǔ)上確定的實(shí)驗(yàn)方劑，由三七、赤芍、血竭、骨碎補(bǔ)等7味中藥組成，具有活血止血、散瘀止痛等作用，用于急性軟組織損傷等癥臨床療效顯著，藥理實(shí)驗(yàn)表明該制劑在減輕損傷組織，促進(jìn)血腫吸收和瘀斑消散等方面作用確切[1]。為有效控制三七活血片的質(zhì)量，保證用藥安全有效，本研究建立三七活血片的質(zhì)量控制方法。采用薄層色譜法，以三七的主要功效成分人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1為對(duì)照，對(duì)方中三七進(jìn)行定性鑒別。為增加方法的專(zhuān)屬性及信息的全面性，以血竭特征性成分血竭素高氯酸鹽及血竭對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)方中血竭進(jìn)行定性鑒別。處方中赤芍用量最大且為主要藥味，故采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1　儀器與試藥

LC-10 AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-10A紫外檢測(cè)器（日本島津公司），KQ-250型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器公司），AE163電子天平（瑞士梅特勒公司）。

人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)110703-201128，供含量測(cè)定用）、三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)110745-201318供含量測(cè)定用）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)110704-201223，供含量測(cè)定用）、血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（批號(hào)110811-201105，供含量測(cè)定用）、血竭對(duì)照藥材（批號(hào)906-9905）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201337，供含量測(cè)定用），中國(guó)食品藥品檢定研究院。3批三七活血片（批號(hào)20140601、20140602、20140603，0.5 g/片）及陰性對(duì)照品，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室自制。硅膠G板（手鋪，青島海洋化工有限公司），水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1三七取三七活血片3片，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理（功率500 W，頻率20 kHz）20 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL微熱使溶解，加乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液繼用水飽和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用正丁醇飽合氨試液洗滌2次，每次15 mL，棄去堿液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取去掉三七的其他藥材，按三七活血片制備工藝操作，制成不含三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備不含三七的陰性對(duì)照溶液。另取人參皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置過(guò)夜的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，其Rf值適宜，顯色清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性較好。

2.1.2血竭取三七活血片2片，研細(xì)，加乙醚10 mL，超聲處理（功率500W，頻率20 kHz）5 min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。取除血竭的其他藥材，按三七活血片制備工藝制成不含血竭的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備不含血竭的陰性對(duì)照溶液。另取血竭對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干[2-3]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，其Rf值適宜，顯色清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性較好。

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件Shim-pack（島津）C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃[4]。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。2.2.2對(duì)照品溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成67.4 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取三七活血片20片，研細(xì)，取粉末0.25 g，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理（功率500 W，頻率20 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例制備不含赤芍的陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。2.2.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入色譜儀測(cè)定。結(jié)果供試品溶液中待測(cè)成分色譜峰與芍藥苷對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且與雜質(zhì)峰可達(dá)到良好的分離，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，表明本方法專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.6線(xiàn)性關(guān)系考察精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（67.4 μg/mL）4、8、12、16、20 μL，分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得回歸方程。Y＝662 679.976X－2903.064，r＝0.999 8，表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.269 6～1.348 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積成良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.7精密度試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果芍藥苷的峰面積RSD＝0.63%，表明儀器精密度良好。

圖1　三七活血片中芍藥苷HPLC圖

2.2.8穩(wěn)定定性試驗(yàn)精密吸取三三七活血片（批號(hào)20140601）供試品溶液液10 μL，每隔3 h進(jìn)樣1次，連續(xù)考察244 h，結(jié)果芍芍藥苷峰面積RSD＝0.68%，表明供試品溶溶液中指標(biāo)性性成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)復(fù)性試驗(yàn)按按“2.2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)對(duì)同一批號(hào)三七活活血片（批號(hào)20140601），平行制備66份供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定定。芍藥苷平均含量為12.13mg/g，RSD＝1.44%，表表明該方法重復(fù)性性良好。

2.2.10加加樣回收率試試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知芍藥苷含量的同一批批三七活血片樣品（批號(hào)20140601）6份，每份約0.112 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入濃度為0.756 2 mg/mmL的芍藥苷苷對(duì)照品2 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備備供試品溶液液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　芍藥藥苷加樣回收率試試驗(yàn)

2.2.11樣品含量測(cè)定取3批三七活血片樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備3份，測(cè)定芍藥苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　樣品測(cè)定結(jié)果（mg/片，n＝33）

3　討論

制備三七薄層鑒別的供供試品溶液時(shí)，本研究考察了氨試液、0.55%氫氧化鈉溶溶液及1%氫氧化鈉溶液洗滌效果，均可達(dá)達(dá)到較好分離離效果，而以氨試液洗滌操作更簡(jiǎn)便，不需需再用水洗滌滌。筆者曾嘗試對(duì)方中的骨碎補(bǔ)進(jìn)行定性鑒別，以柚皮皮苷對(duì)照品為對(duì)照，試驗(yàn)了多種鑒別方法，但未能消除除陰性對(duì)照中的干擾。

另外，曾嘗嘗試用HPLCC對(duì)方中三七所含有效成成分人參皂苷Rg1、、Rb1及三七七皂苷R1的總量進(jìn)行測(cè)定定，因供試品色譜中待測(cè)成分未未得到較好分離，測(cè)定結(jié)結(jié)果重重復(fù)性不好，未采用。

對(duì)赤芍有效成分芍藥苷苷進(jìn)行含量測(cè)測(cè)定，本試驗(yàn)驗(yàn)參考考文獻(xiàn)[5-6]，對(duì)供試品溶液液的制備方法法進(jìn)行了考察察。分分別考察了500%甲醇、70%%甲醇、甲醇醇的提取效果果，結(jié)結(jié)果以甲醇提取效果最好；；通過(guò)比較超聲提取法和加熱熱回流提取法法，發(fā)現(xiàn)超聲聲提取效果較好且操作更簡(jiǎn)單單；分別考察了乙腈-0.3%%磷酸水溶液（12.7∶87.3）、乙乙腈-0.3%磷酸酸水溶液（16∶84）、乙腈-0.3%磷酸水溶溶液（15.2∶884.8）作為流流動(dòng)相對(duì)樣品分離效果的影響響，結(jié)果以乙腈腈-0.3%磷酸酸水溶液（155.2∶84.8）為流動(dòng)動(dòng)相得到的分離效果最佳，，峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間短且陰性對(duì)照無(wú)干擾。在測(cè)定時(shí)時(shí)還發(fā)現(xiàn)芍藥藥苷保留時(shí)間不宜宜過(guò)長(zhǎng)，否則易產(chǎn)生拖尾。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳文學(xué),于德偉偉.三七活血片抗軟軟組織損傷、鎮(zhèn)痛與抗炎藥理作用研究[J].中國(guó)藥房,2015,26(9)：3482.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì)會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[MM].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：147.

[3] 高燕妮,高武翔翔.跌打七厘片的鑒鑒別及含量測(cè)定方法改進(jìn)[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,33((9)：117.

[4]] 葛美廳,胡雙豐豐.血竭與龍血竭的定性鑒別[J].中國(guó)藥事,2010, 119(22)：85.

[5]] 高穎,房德敏.蘇蘇氏接骨膠囊中骨碎補(bǔ)和菟絲子的質(zhì)量控制[J].中國(guó)醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)雜志,20010,30(4)：333.

[6]] 王建,劉金花.反反相高效液相色譜譜法測(cè)定胃靈顆粒中芍藥苷含量[J].中中國(guó)藥業(yè),2015,224(1)：45.

（修回日期：2015-04-09；編輯：陳靜）

Sduty on Quality Sdandard for Sanqi Huoxue Tablets

WANG Zhao-hua1, JI Yi-bo2, ZHANG Da-jun1(1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012, China; 2. Jilin Medical Device Testing Institute, Changchun 130062, China)

Abstract:Objective To establish the quality standard for Sanqi Huoxue Tablets. Methods Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets were identified by TLC qualitatively; The content of paeoniflorin in Paeoniae Radix Rubra was determined by HPLC. The separation was performed on Shim-pack-C18column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid (15.2:84.8, V/V) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm, and the column temperature was 30 ℃. Results Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets could be identified by TLC and separated well. Paeoniflorin was in a good linear relationship between 0.269 6–1.348 μg, with a correlation coefficient of 0.999 8. Solution was stable within 24 h, and the average recovery of paeoniflorin was 98.68%, RSD=0.78%. Conclusion The established method is simple, accurate and sensitive, and can be applied to the quality control of Sanqi Huoxue Tablets.

Key words:Sanqi Huoxue Tablets; quality standard; Notoginseng Radix et Rhizoma; Draconis Sanguis; TLC; HPLC; paeoniflorin

收稿日期：（2015-03-17）

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130727005YY）；長(zhǎng)春市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14KG067）

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0087-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.024