鄧傳江+高鐵燕+楊勇+孫楠+洪梅+余壘柱

[摘 要]目的：建立用超高效液相色譜法測(cè)定三七中人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3與三七皂苷R1的方法，以進(jìn)一步探討超高效液相色譜法用于控制三七質(zhì)量的可行性。方法：色譜柱為UPLC BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相為A相（乙腈）-B相（水溶液），梯度洗脫程序?yàn)椋?/p>

0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速為0.4 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。結(jié)果：本法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，四種皂苷的線性范圍寬，R值均大于0.999，方法學(xué)總回收率為99.88% ，RSD為0.44%（n=3）。結(jié)論：方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于三七藥材中三七總皂苷的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]超高效液相色譜法；三七；人參皂苷Rg1 、Rb1、Rb3；三七皂苷R1

中圖分類號(hào)：TS580 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）25-0113-02

[Abstract]OBJECTIVE To determine total notoginseng glycosides in notoginseng by UPLC for quality contro1， further explore the quality control of notoginseng by ultra-high performance liquid chromatography. METHODS An UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm，1.7μm） column was used with a mobile phase consisted of phase A（Acetonitrile）-phase B （Secondary ultrapure water） in gradient elution 0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）by flow rate of 0.4mL·min-1 in this method，and UV detector was set at 203nm. RESULTS The linear range of three glycosides were all wide（r>0.999）.The range of recovery of total notoginseng glycosides in notoginseng was 99.88% （RSD=0.44%）（n=3）.CONCLUSIONS The method developed is rate，simple，rapid and reproducible，Which can be applied for the quality control of notoginseng tablets.

[Key words]UPLC； notoginseng； ginsenosidesRg1， Rb1， Rb3； notoginsenoside R1。

三七是云南道地特產(chǎn)中藥材，來(lái)源于五加科人參屬植物Panax notoginseng-（Burk. ） F. H. Chen 的干燥根，有散瘀止血，消腫定痛之功效。用于咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌打腫痛等，主產(chǎn)于云南省文山州。三七主要含有皂苷、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分。三七總皂苷含有人參皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 和三七皂苷R1，R2，R3，R4，R6 等20 余種皂苷成分。其中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1，是三七總皂苷中含量最高的兩個(gè)成分，而三七皂苷R1則是三七總皂苷的特征化合物，但含量較低。三七總皂苷的測(cè)定方法主要有：HPLC法、比色法、薄層掃描法等。但目前采用超高液相測(cè)定三七中的三七總皂苷的方法尚未報(bào)道。本文重點(diǎn)就采用超高液相測(cè)定三七總皂苷的檢測(cè)和分析方法進(jìn)行全面的綜述。

1 儀器與試劑

Waters Acquity型超高效液相色譜儀（配置：紫外檢測(cè)器、帶脫氣四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器）。色譜純乙腈，色譜純甲醇，超純水（自制）。三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3對(duì)照品（北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院），三七粉、三七主根粉、三七花粉、三七剪口粉、三七莖葉粉（自購(gòu)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜分析條件：ACQUITY UPLC BEH Cl8 1.7μm（2.1×50 mm）；流動(dòng)相：A相（乙腈）一B相（水溶液），梯度洗脫程序?yàn)椋?min（20：80） -0.4min（30：70）- 1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速為0.4 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；進(jìn)樣量：4μL，外標(biāo)法定量。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 對(duì)照品混合溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg/mL 的對(duì)照品混合儲(chǔ)備液；精密吸取2.0mL置100 mL容量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 三七除去泥土洗凈后，晾干，粉碎，過(guò)100目篩.取細(xì)粉。精密稱取本品細(xì)粉（三七粉、三七主根粉、三七剪口粉約2g，三七花粉約4g、三七莖葉粉約8g）置50 ml 具塞離心管中，加入甲醇15mL，密塞，搖勻，超聲30 min后；置于離心機(jī)上10000ran/min離心30min。上清液置于50.0 ml比色管中。按上述操作重復(fù)超聲、離心兩次后，用甲醇定容，搖勻，取樣液，經(jīng)O.2μm 濾頭過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 測(cè)定方法 分別取對(duì)照品混合溶液及供試品溶液于樣品瓶中經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器吸取4μL樣液注入超高液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品混合溶液色譜圖中三七皂苷R1 、人參皂苷Rg1 、Rb1、Rb3 的峰面積外標(biāo)法計(jì)算三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3的含量。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 日內(nèi)精密度取同一批供試樣品，在同一天時(shí)間里，分別于2、4、6、8、10、24h進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算三七總皂苷含量，進(jìn)行精密度分析，結(jié)果顯示平均含量為100.57%，RSD為1.26%。表明該方法測(cè)定含量日內(nèi)精密度良好。中間精密度取供試樣品，在連續(xù)5d時(shí)間里，分別每天取樣進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算三七總皂苷含量，進(jìn)行精密度分析，結(jié)果顯示平均含量為100.8% ，RSD為1.35%。表明該方法測(cè)定含量精密度良好。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取對(duì)照品人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg/mL 的對(duì)照品溶液。用移液器分別吸取上述對(duì)照品溶液10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μL加甲醇-水（70：30）溶液稀釋至1.0mL，搖勻；制成人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號(hào)系列濃度溶液；分別?、?、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號(hào)溶液于樣品瓶中經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器吸取4μL樣液注入超液相色譜儀測(cè)定；記錄峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表l。

2.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品，精密加入三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Rbl、Rb3對(duì)照品各2mg，按照“2.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理得供試品溶液，測(cè)定每份樣品的含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品共6份按照供試品溶液的制備方法制備三七樣品溶液，上機(jī)測(cè)定并分別計(jì)算人參皂苷及三七皂苷的含量，結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3和三七皂苷R1含量的RSD分別為0.84%、0.92%、0.87%、0.58% ，三七中各皂苷峰面積積分值變化不大。表明該方法測(cè)定含量重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 通過(guò)對(duì)三七中4種主要有效成分三七皂苷Rl以及人參皂苷Rg1、Rbl、Rb3含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的三七上述4種皂苷的含量相差較大，相同規(guī)格三七的不同部位上述4種皂苷的含量也存在差異，采用超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定上述4種皂苷的含量，分離效能高、重現(xiàn)性好、精密度良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、分析時(shí)間短。

3.2 討論 本文對(duì)提取方法進(jìn)行了優(yōu)化選擇并與GB/T 19086-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 文山三七》中的提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)采用的方法，操作過(guò)程中三七樣液的三七總皂苷損失更少；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，整個(gè)分析過(guò)程在2min內(nèi)完成，進(jìn)樣間隔2-3min即可達(dá)到平衡，大大的縮短了檢測(cè)分析時(shí)間。

4 結(jié)論

本文所建立的梯度洗脫超高液相色譜法，分離效能高、重現(xiàn)性好、精密度良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、分析時(shí)間短為檢測(cè)三七及其三七制品中的三七總皂苷的含量提供了一定的依據(jù)和參考。

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