康玉霞，雷　丸，王　瑩，郭飛燕，王曉娟*(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽　71046；.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，西安　71003)

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蘭花顆粒質(zhì)量標準研究

康玉霞1，2，雷丸2，王瑩2，郭飛燕2，王曉娟2*(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽712046；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，西安710032)

摘要：目的建立蘭花顆粒的質(zhì)量標準。方法采用薄層色譜法(TLC)鑒別本制劑中的板藍根、大青葉和忍冬藤；采用高效液相色譜法(HPLC)測定制劑中(R，S)-告依春的含量，色譜柱為Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(7∶93)；檢測波長為245 nm。結(jié)果在選定的薄層色譜條件下，斑點顯色清晰，分離效果良好。(R，S)-告依春質(zhì)量濃度在0.30~2.12 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)；平均回收率為87.5%，RSD為1.0%(n=9)。結(jié)論該方法專屬性強、重復(fù)性好、簡便可行，可用于蘭花顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蘭花顆粒；(R，S)-告依春；薄層色譜；高效液相色譜;

皰疹性口炎病原體為Ⅰ型皰疹病毒引起的急性口腔黏膜炎癥[1]，嬰幼兒感染多為原發(fā)性，無明顯季節(jié)性，一年四季散發(fā)[2]。研究發(fā)現(xiàn)皰疹病毒集中于完整皰疹液內(nèi)，潰破后引發(fā)感染癥狀，使得疼痛嚴重[3]。蘭花顆粒是由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑，主要由板藍根、大青葉、忍冬藤等五味中藥組成，具有清熱解毒、解表通便之功效，主治皰疹性口炎、病毒性上呼吸道感染、四時感冒等癥。板藍根具有清熱解毒、涼血利咽[4]、調(diào)節(jié)和保護機體免疫力的作用[5]。大青葉具有清熱解毒、利咽止痛[6]、抑制病原微生物和提高機體免疫力的作用[7]。為有效控制藥品質(zhì)量、保證藥品療效，筆者對蘭花顆粒的質(zhì)量標準進行研究，采用薄層色譜法對板藍根、大青葉和忍冬藤進行鑒別，并采用高效液相色譜法對板藍根中的主要藥效成分(R，S)-告依春進行含量測定，建立可控制該制劑質(zhì)量的標準。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(LC-20AT，日本島津公司)；KQ5200E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(BT125D，德國賽多利斯公司)；離心機(LD5-10，北京醫(yī)用離心機廠)。

1.2試藥靛玉紅對照品(批號110717-200204，質(zhì)量分數(shù)100%)、板藍根對照藥材(批號121117-200302)、大青葉對照藥材(批號121367-200602)、忍冬藤對照藥材(批號121069-201105)、(R，S)-告依春對照品(批號111753-201304，質(zhì)量分數(shù)99.9%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；蘭花顆粒(規(guī)格：12 g×10包/盒，批號：140807，140909，141013，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科)；蘭花顆粒(大青葉、板藍根陰性，自制)；蘭花顆粒(忍冬藤陰性，自制)；蘭花顆粒(板藍根陰性，自制)；甲醇為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1大青葉、板藍根TLC鑒別取本品2包，研細，加氯仿30 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 mL復(fù)溶，作為供試品溶液[8]。另取大青葉、板藍根對照藥材各1 g，同法制成大青葉、板藍根對照藥材溶液。再取靛玉紅對照品，加三氯甲烷制成1 mL含0.1 mg的對照品溶液。再取大青葉、板藍根陰性樣品24 g，按照供試品的制備方法制成陰性對照溶液。依照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取供試品溶液、對照品溶液、大青葉對照藥材溶液、板藍根對照藥材溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1大青葉與板藍根薄層色譜圖

1~3.供試品；4.靛玉紅對照品；5.大青葉對照藥材；6.板藍根對照藥材；7.陰性對照

Fig.1 TLC ofRadixisatidisandFoliumisatidis

1-3.sample solution；4.indirubin control substance；5.Foliumisatidisreference substance；6.Radixisatidisreference substance；7.negative control

2.1.2忍冬藤TLC鑒別取本品2包，研細，加體積分數(shù)為50%的甲醇40 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液[9]。另取忍冬藤陰性樣品24 g,同法制成陰性對照溶液。再取忍冬藤對照藥材1 g，加入體積分數(shù)為50%的甲醇10 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為對照藥材溶液。依照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積分數(shù)為10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

圖2 忍冬藤薄層色譜圖

1~3.供試品；4.忍冬藤對照藥材；5.陰性對照

Fig.2 TLC ofCaulislonicerae

1-3.sample solution；4.Caulisloniceraereference substance；5.negative control

2.2含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(7∶93)；檢測波長：245 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；理論板數(shù)按(R，S)-告依春峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取(R，S)-告依春對照品5.05 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.01 mg·mL-1的對照品母液。精密吸取該對照品母液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1的對照品儲備溶液。再量取對照品儲備溶液0.38 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.52 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取蘭花顆粒5包,研細，混合均勻，取10 g，精密稱定。加水100 mL，回流2 h，取出，放冷，加水補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4陰性對照溶液的制備取板藍根陰性樣品適量，按照2.2.3項下的方法制備陰性對照溶液。

2.2.5專屬性實驗精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按照2.2.1項下的色譜條件進樣測定，結(jié)果顯示，供試品溶液與對照品溶液的保留時間一致，陰性對照溶液在(R，S)-告依春相應(yīng)的保留時間內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，表明在該色譜條件下(R，S)-告依春的吸收良好，蘭花顆粒中其他成分對(R，S)-告依春的測定無干擾。見圖3。

圖3HPLC圖

a.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照；1.(R，S)-告依春

Fig.3 HPLC chromatograms

a. (R，S)-goitrin control substance；B.sample solution；C.negative control；1.(R，S)-goitrin

2.2.6線性關(guān)系考察精密量取對照品儲備溶液0.30，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80和2.10 mL,分別置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.30，0.61，0.91，1.21，1.52，1.82和2.12 μg·mL-1的對照品系列溶液。精密吸取上述對照品系列溶液各10 μL，按照2.2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以(R，S)-告依春對照品的峰面積(Y)對(R，S)-告依春的進樣質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=59 879X+3 681.4(r=0.999 7)，表明(R，S)-告依春質(zhì)量濃度在0.30~2.12 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7精密度實驗按照2.2.1項下的色譜條件，精密吸取(R，S)-告依春對照品溶液(1.52 μg·mL-1)10 μL，重復(fù)進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計算其RSD為0.79%，表明儀器精密度良好。

2.2.8穩(wěn)定性實驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，在0，2，4，6，8，10和12 h時，按照2.2.1項下的色譜條件，分別進樣測定，記錄其峰面積值，計算RSD為1.66%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9重復(fù)性實驗取同一批蘭花顆粒(批號140807)內(nèi)容物，按照2.2.3項下的方法，制備6份供試品溶液，并按照2.2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果顯示,(R，S)-告依春的平均含量為14.31 μg·g-1，RSD為1.90%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10加樣回收率實驗分別稱取5.0 g已知含量(每克含有(R，S)-告依春14.31 μg)的蘭花顆粒9份，精密稱定，分別按照高、中、低質(zhì)量濃度加入一定量的(R，S)-告依春對照品儲備溶液，加水100 mL，回流2 h，取出，放冷，加水補足減失的質(zhì)量，搖勻。精密吸取10 μL，然后按照2.2.1項下的色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery tests

(n=9)

2.2.11樣品含量測定精密稱取3批蘭花顆粒(批號140807，140909，141013)，按照2.2.3項下的制備方法進行制備，按照2.2.1項下的色譜條件進樣測定，并計算樣品中(R，S)-告依春的含量，分別為168.36，175.32和171.60 μg·袋-1，平均含量為171.76 μg·袋-1。

3討論

在板藍根的薄層鑒別中，筆者考察了以下條件：3種提取溶劑：體積分數(shù)為70%的乙醇[10]、稀乙醇[11]和乙酸乙酯[12]；3種展開系統(tǒng)：正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)[11]，三氯甲烷-甲醇(4∶1)[13]，三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶4∶1)[12]；2種顯色劑：茚三酮試液[11]，磷鉬酸試液[13]。對上述條件進行分析比較。用體積分數(shù)為70%的乙醇提取時，樣品因含糖量過大，點樣困難，干擾較大，薄層色譜圖較難辨認，不予采用。嘗試其余的方法，薄層色譜圖均能呈現(xiàn)斑點，分離度良好，顯色清晰的效果，但陰性均有干擾。由于處方中板藍根和大青葉來源于同一植物，只是部位不同，兩者含有共有成分，因此專屬性不強。通過查閱相關(guān)文獻[6]，最終選擇用靛玉紅鑒別制劑中的板藍根和大青葉。

在(R，S)-告依春的含量測定中，考查了幾種不同的流動相系統(tǒng)：甲醇-0.5 mL·L-1的磷酸溶液(7∶93)[14]、甲醇-0.2 mL·L-1磷酸溶液(7∶93)[15]、甲醇-水(7∶93)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果無明顯差異，故選擇了甲醇-水(7∶93)為流動相系統(tǒng)。

板藍根為本方的君藥，其主要成分為(R，S)-告依春，故筆者在本質(zhì)量標準研究中建立了(R，S)-告依春的含量測定方法。通過本實驗建立的薄層鑒別方法和高效液相色譜含量測定方法對3批樣品進行質(zhì)量控制，發(fā)現(xiàn)本方法簡便易行、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于蘭花顆粒的質(zhì)量控制。

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Study on the quality standard of Lanhua Granules

KANG Yuxia1，2，LEI Wan2，WANG Ying2，GUO Feiyan2，WANG Xiaojuan2*(1.College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China；2.State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pharmacy，School of Stomatology，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

Abstract:Objective To establish the quality standard of Lanhua Granules. Methods Radix isatidis，F(xiàn)oliumi isatidis and Caulis lonicerae stem in Lanhua Granules were identified qualitatively by TLC.The content of (R，S)-goitrin in the preparation was determined by HPLC.The chromatographic column was Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)， with methanol-water(7∶93) as the mobile phase， detection wavelength at 245 nm. Results Under the selected TLC conditions，the spots were clear，and the separation effect was good. (R，S)-goitrin showed a good linear relationship in the range of 0.30-2.12 μg·mL-1with r=0.999 7，and the average recovery was 87.5% with RSD 1.0% (n=9). Conclusion The method is specific，repeatable and simple, and can be used for the quality control of Lanhua Granules.

Key words:Lanhua Granules；(R，S)-goitrin; TLC；HPLC

(收稿日期：2015-06-11)

*通信作者：王曉娟，女，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師

作者簡介：康玉霞，女，在讀碩士研究生

基金項目：口腔?？铺厣菢藴手苿藴侍岣哐芯?編號：14ZJZ06)

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0138-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.009