朱晨孔榮方詩元* 何年安夏睿徐婷娟李乾明黃威王磊朱思強

朱晨1,2孔榮1方詩元1* 何年安3夏睿1徐婷娟4李乾明1黃威1王磊1朱思強1

目的探討股骨頸骨折的滑膜組織、人工關(guān)節(jié)無菌性松動和假體周圍感染的界膜組織中人 -防御素-3（HBD-3）的表達差異。方法 30例患者，其中因假體周圍感染進行髖關(guān)節(jié)翻修的患者、因無菌性松動接受髖關(guān)節(jié)翻修的患者以及因股骨頸骨折接受髖關(guān)節(jié)置換的患者各10例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、實時定量聚合酶鏈反應（Realtime PCR）、免疫組化染色分析及免疫印跡分析（Western blot）進行假體周圍界膜組織或滑膜組織中HBD-3表達水平的檢測并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果RealtimePCR發(fā)現(xiàn)，假體周圍感染后界膜組織中HBD-3 mRNA的表達，明顯高于無菌性松動界膜組織和股骨頸骨折滑膜組織中HBD-3的表達。與創(chuàng)傷性滑膜組織相比，細菌感染刺激引起界膜組織中HBD-3的釋放增加約5倍以上；與非感染性的無菌性松動界膜組織相比，HBD-3的釋放增加約2倍以上。免疫組化染色顯示局部細菌炎癥刺激條件下，與無菌性松動界膜組織相比，感染導致界膜組織中的成纖維細胞和成骨細胞分泌 HBD-3增加。Westenblot顯示，與非炎癥組相比，葡萄球菌在局部定植引起組織中HBD-3蛋白水平顯著提高。結(jié)論HBD-3在感染性界膜組織和無菌性松動界膜組織之間表達差異顯著。未來，HBD-3一個可行的臨床應用可以通過術(shù)中界膜組織的病理活檢，來區(qū)別人工關(guān)節(jié)假體周圍感染和無菌性松動。

-防御素；骨感染；耐藥葡萄球菌；植入物

內(nèi)植物相關(guān)的骨與關(guān)節(jié)感染，難以治愈，反復發(fā)作，目前已成為嚴重困擾骨科醫(yī)生的難題，早期診斷尤為困難。美國每例人工關(guān)節(jié)感染的治療費用平均大于5萬美元，每年用于治療人工關(guān)節(jié)感染的費用可高達10億美元[1]。因此，探尋一種新的針對內(nèi)植物相關(guān)的骨關(guān)節(jié)感染的早期鑒別診斷策略已勢在必行。最近的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌可以誘導人成纖維細胞和成骨細胞分泌人 -防御素-3（Human -defensin-3,HBD-3）[2,3]。HBD-3是人體自身分泌的一種內(nèi)源性抗菌肽，具有無毒、廣譜、理化性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌活性強以及調(diào)節(jié)自身免疫的特性[4,5]。本文將調(diào)查股骨頸骨折的滑膜組織、人工關(guān)節(jié)無菌性松動和假體周圍感染的界膜組織中HBD -3的表達差異以及炎癥感染對抗菌肽潛在的誘導作用，以明確HBD-3是否在內(nèi)植物感染的炎癥過程中發(fā)揮作用以及HBD-3是否可以做為假體周圍感染的炎癥標記物。

1 材料和方法

1.1 人體界膜或滑膜標本的采集

10例因假體周圍感染進行髖關(guān)節(jié)翻修的患者，包括7例男性和3例女性，平均年齡為（63±9.8）歲（43～78歲），術(shù)中取股骨假體周圍的界膜組織進行檢測?；颊叩呐R床表現(xiàn)、實驗室檢查及術(shù)中所見，均提示人工關(guān)節(jié)假體周圍感染，術(shù)后細菌培養(yǎng)5例培養(yǎng)為金黃色葡萄球菌和5例為表皮葡萄球菌。10例因無菌性松動接受髖關(guān)節(jié)翻修的患者，4名女性和6名男性，平均年齡為（64.3±5.7）歲（55～73歲），術(shù)中取股骨植入物周圍的界膜獲取組織樣本?；颊叩呐R床表現(xiàn)、實驗室檢查及術(shù)中所見，均提示人工髖關(guān)節(jié)假體無菌性松動；同時均排除因手術(shù)技術(shù)原因，如假體安放不良及股骨側(cè)力線不良導致的假體松動[6]。10例因股骨頸骨折接受髖關(guān)節(jié)置換的患者，包括3名男性和7名女性，平均年齡為（73.9±8.7）歲（61～86歲），術(shù)中取髖關(guān)節(jié)滑膜組織進行標本檢測?；颊吲R床表現(xiàn)、實驗室檢查及術(shù)中所見均排除細菌感染、強直性脊柱炎、類風濕關(guān)節(jié)炎或其它髖關(guān)節(jié)炎癥。上述3組標本，一半固定在液氮中，另一半4%福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋。隨后，所有樣品均進行 HBD-3表達的檢測[7]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

人標本組織進行液氮凍存，實驗前從液氮取出，并用pH值7.5的含NaCl 150mm、20 mM Tris-HCl緩沖液及1%的Triton X-100混勻。勻漿離心后取上清200L用ELISA試劑盒進行檢測（伊艾博科技有限公司，武漢，中國），并按操作說明進行。標準參照或檢測樣品均加入到96孔微量滴定板，并與生物素標記的 HBD-3抗體37℃孵育2小時，隨后PBS+0.1%吐溫20清洗微量滴定板3次，再與辣根過氧化物酶抗生物素蛋白100 L在每個培養(yǎng)孔37℃暗光條件下孵育1h，然后90L 3.3'，5.5'四甲基聯(lián)苯胺作為顯色劑，再被添加到每個培養(yǎng)孔內(nèi)孵育15分鐘，最后50 L硫酸溶液終止反應。各樣本重復檢測3次，樣本在波長450nm的光學密度值使用Synergy HT酶標儀進行測量。重組HBD-3以下列各濃度值作為標準參照：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、120 ng/L[8]。

1.3 免疫組化染色分析

免疫組化檢測HBD-3在滑膜或界膜組織中的表達。人體標本進行脫水和石蠟包埋。所有的脫蠟切片3%過氧化氫在室溫下封閉10分鐘，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶。HBD-3（1∶500，NovusBiologicals,Littleton,CO,USA）多克隆一抗進行免疫組化染色，再用生物素標記的二抗孵育以及過氧化物酶標記的鏈霉親和素生物素染色技術(shù)（DAKO,Glostrup，丹麥）。對于HBD-3，正常人體皮膚組織被用來作為陽性對照[7]。當抗菌肽與抗體結(jié)合產(chǎn)生陽性反應時，可顯示一個棕色的反應產(chǎn)物在組織內(nèi)的沉積。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應（Realtime PCR）

人體組織標本液氮凍存后取出粉碎，根據(jù)RNeasyminikit試劑盒（Qiagen,Valencia,CA,USA）說明書，按操作說明提取總RNA，使用DNase I（Fermentas）去除基因組殘留的DNA并進行純度測定。然后根據(jù)FermentasRevertAidFirst Strand cDNA SynthesisKit試劑盒操作要求，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后根據(jù)Roche FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒操作說明，在 ABI 7500 Real TimePCR反應儀上進行PCR操作。所用基因的引物序列及退火溫度見下表1， -actin為基因表達水平的內(nèi)參基因?；虮磉_的定量分析，以每個樣品的CT值為基礎，每個樣品平均重復3次測定[8,9]。

表1 本研究中所用引物的核苷酸序列

1.5 免疫印跡分析（Western blot）

人體標本中提取總蛋白根據(jù)試劑盒制造商（ProMabBiotechnologies）的操作手冊進行。蛋白質(zhì)定量根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒（PierceBiotechnology）進行。每份樣品均含蛋白（40 g/Lane），12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離經(jīng)電轉(zhuǎn)移到PVDF硝酸纖維素膜（Whatman），再用TBST（Tris緩沖溶液含0.1%吐溫20）在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h。然后一抗（HBD-3，1∶300，Novus,NB200-117）浸潤4°C過夜，二抗（GoatAntiRabbitIgG/HRP,1∶5000）室溫下再孵育1 h。最后，硝酸纖維素膜用化學發(fā)光增強，pro4.0凝膠分析儀（Media Cybernetics）分析條帶灰度值及IOD，以積分灰度值代表蛋白表達量，每個實驗均重復3次[8,9]。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 葡萄球菌感染后假體界膜組織中HBD-3的釋放評估

通過Realtime PCR檢測發(fā)現(xiàn)，假體周圍感染后界膜組織中HBD-3 mRNA的表達，明顯高于非感染的無菌性松動界膜組織和股骨頸骨折滑膜組織中HBD-3的表達（圖1A）。與創(chuàng)傷性滑膜組織相比，細菌感染刺激引起界膜組織中HBD-3的釋放增加約5倍以上；與非感染性的無菌性松動界膜組織相比，HBD-3的釋放增加約2倍以上（圖1B）。免疫組化染色顯示局部細菌炎癥刺激條件下，與無菌性松動界膜組織相比，細菌性炎癥感染將導致界膜組織中的成纖維細胞和成骨細胞分泌HBD-3增加，免疫組化染色強度增強（圖2，3，圖2彩圖見插頁）。此外，不同的致病菌種之間，金葡菌與表皮葡萄球菌，沒有明顯的差異。所有的滑膜組織染色顯示，僅僅在成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)HBD-3的免疫組化染色反應陽性（圖2）。如圖4所示，通過對HBD-3的濃度分析，可見抗菌肽HBD-3分子量相對應區(qū)域中出現(xiàn)單一條帶。與非炎癥組相比，葡萄球菌在局部定植引起組織中HBD-3蛋白水平顯著提高。此外，股骨頸骨折的滑膜組織與無菌性松動的界膜組織之間HBD-3的蛋白水平亦有顯著差異。水平以 -actin為內(nèi)參基因。mRNA表達水平是與對照組的mRNA水平相比，相對的mRNA水平。ELISA顯示HBD-3表達的基線水平（B）。細菌性骨感染時，HBD-3分泌水平升高，表明細菌誘導HBD-3分泌增加。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（SD）表示。*2組之間的差異有統(tǒng)計學意義，＜0.05染（c）。用特異性抗體孵育后，骨折組（a）和無菌性松動組（b）僅顯示只有微弱的檢測。Western blot定量檢測分析 HBD-3蛋白水平的IOD值（B）。不同組的蛋白水平以GAPDH為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（SD）表示。*2組之間的差異有統(tǒng)計學意義，＜0.05

圖1Real-time PCR分析HBD-3mRNA的表達（A）。HBD-3的表達

圖2 免疫組化分析細菌感染的界膜組織中HBD-3的表達。股骨頸骨折（A），無菌性松動（B）和假體周圍感染（C，金黃色葡萄球菌和D，表皮葡萄球菌）顯示所有檢測的組織樣本，均見不同水平的HBD-3分布。免疫組化檢測顯示，感染的界膜組織樣本中HBD-3抗體免疫組化染色反應明顯。染色主要發(fā)現(xiàn)在成纖維細胞（黑色箭頭）和骨細胞（白色箭頭）的細胞外基質(zhì)。原始放大倍數(shù)×400

圖3 免疫組化染色定量積分光密度值（IOD）分析HBD-3的表達。股骨頸骨折、無菌性松動和假體周圍感染的標本進行評估。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（SD）表示。*2組之間的差異有統(tǒng)計學意義，＜0.05

圖4 Western blot免疫印跡分析檢測感染的界膜組織標本中HBD-3蛋白表達升高（A）。股骨頸骨折（a）、無菌性松動（b）和假體周圍感

3 討論

本研究表明在炎癥感染條件下，HBD-3做為人體自身分泌的可誘導的抗菌肽在人工關(guān)節(jié)假體周圍界膜組織中表達增高。以往的研究表明，帶正電荷的HBD-3可以較容易的通過靜電作用與菌膜表面的負電荷相連接，繼而通過膜內(nèi)分子間的相互位移形成離子性通道，造成細菌膜結(jié)構(gòu)破壞，使細菌失去膜勢而死亡[10]。在假體周圍感染的界膜組織標本中，采用免疫組化、Realtime PCR、ELISA和Western blot發(fā)現(xiàn)，當病原菌金葡菌或表皮葡萄球菌接觸成骨細胞及成纖維細胞時，HBD-3表達并上調(diào)至較高的水平。與假體周圍感染相比，在所有無菌性松動的界膜組織中，HBD-3的表達則明顯降低。此外，與感染的界膜組織相比，筆者僅在部分滑膜組織的免疫組化檢測中發(fā)現(xiàn)HBD-3分布，顯示HBD-3的分泌表達與局部菌群的生長狀態(tài)以及感染的程度密切相關(guān)[2,3,8]。以往研究還表明， -防御素還參與宿主先天性免疫和適應性免疫反應的調(diào)節(jié)。Presicce[11]等人提供的數(shù)據(jù)也顯示，在人單核細胞來源的樹突狀細胞中，HBD-1具有誘導成熟標志物[例如主要組織相容性復合體（Majorhistocompatibility complex,MHC）II類和CD83]、共刺激標記物（例如CD80，CD86和 CD40）以及促炎癥細胞因子（例如 TNF-、IL-6和IL-12p70）表達的能力。Sabag[12]等研究則發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌感染的小鼠模型中，HBD-3可以調(diào)控CD4+，提高Th1 mRNA的表達，刺激IL12A及IFN分泌，抑制炎癥感染的進一步加重。筆者推測，HBD-3可能還具有趨化招募激活白細胞以及APC到炎癥感染的部位調(diào)節(jié)宿主先天性免疫和適應性免疫反應的能力。HBD-3的可誘導性，使HBD-3做為一個炎癥感染的免疫學蛋白標記物，成為早期診斷假體周圍感染的有力候選者[13]。

本實驗研究一個缺陷是，使用新鮮股骨頸骨折的髖關(guān)節(jié)滑膜標本作為對照組。最理想的對照組界膜組織，應取自關(guān)節(jié)假體周圍無感染或不存在無菌性假體松動的患者；而最理想的對照組滑膜組織，則應取自健康成人的滑膜。然而，正常界膜組織是不容易獲得的，因為不存在無菌性假體松動或假體周圍感染的全髖關(guān)節(jié)是很少進行髖關(guān)節(jié)翻修手術(shù)的。同樣，從正常髖關(guān)節(jié)得到滑膜組織的機會也是十分困難的。另一種選擇對照組的方法，則是選擇新鮮的股骨頸骨折的髖關(guān)節(jié)滑膜，雖然創(chuàng)傷性滑膜會顯示出比正常的滑膜輕微的炎癥反應以及水平稍高的促炎細胞因子[14]。更重要的是，與正?；は啾?，創(chuàng)傷性滑膜可能會減少，而不是增加，界膜和對照組滑膜之間的差異。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，急性創(chuàng)傷或多發(fā)傷會誘發(fā)內(nèi)源性抗菌肽，包括HBD-3的釋放，使傷者血清的抗感染能力比健康人增強[15]。因此，如果正?；ぷ鳛閷φ战M，界膜和對照組滑膜之間的差異可能增大而不是縮小。雖然本研究的樣本數(shù)量有限，然而，結(jié)果已清楚的表明所有的病例標本中，葡萄球菌感染引起的關(guān)節(jié)假體周圍感染，均誘導界膜中HBD-3表達增高。

炎癥性疾病，無論是人工關(guān)節(jié)假體周圍感染或是非感染的無菌性松動，均為臨床上關(guān)節(jié)外科醫(yī)師面臨的突出問題。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期鑒別感染性與非感染性疾病，對于盡早預防并發(fā)癥以及制定合理的治療方案有重要的意義[16,17]。該研究發(fā)現(xiàn)，由于HBD-3具有抗菌作用，其在感染性界膜組織和無菌性松動界膜組織之間表達差異顯著。未來，HBD-3一個可行的臨床應用，可以通過術(shù)中界膜組織的病理活檢，來區(qū)別人工關(guān)節(jié)假體周圍感染和無菌性松動，以達到術(shù)后合理的治療。由于抗菌肽HBD-3可以選擇性地結(jié)合到細菌的胞膜表面，另一個較實際的方法，可以通過放射性標記 HBD-3，一個潛在的放射性成像藥物，可以在假體周圍感染的組織中特異性的放射性核素成像以早期發(fā)現(xiàn)和診斷假體周圍感染[16,17]。

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Analysis theexpression ofHuman-defensin-3 inhuman interfacial membranesaround periprostheticjointinfection compared with aseptic loosening

Zhu Chen1,2,KongRong1,Fang Shiyuan1,etal.
1DepartmentofOrthopaedicsSurgery;3 Department of Ultrasound; 4 CentralLab,AnhuiProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,HefeiAnhui,230001;2Department ofOrthopaedics, the Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing Jiangsu,210002,China

Objective To investigate the expression of Human -defensin-3(HBD-3)in human interfacial membranes around periprosthetic joint infection compared with aseptic loosening and synovial samples of the hip joints under fracture conditions.Methods The tissue samples of interfacial membranes were obtained from the tissues around the femoral implantsin 10 patients whohadundergone revisiontotal hip replacement because of periprostheticjoint infection,10 patients who had undergone revision total hip replacement because of aseptic loosening of implants and 10 patients who underwent primary hip arthroplasty because of the fresh fracture of the femoral neck.The expression and release of HBD-3 was evaluated using ELISA,Real-time PCR,immunohistochemistry analysis and Western blot,then statistical analysis was carried out.Results By real time-PCR,HBD-3 mRNA transcripts were less detected from the non-infectious interfacial membrane in aseptic loosening and the synovial membrane in femoral neck fracture than the interfacial membrane in periprosthetic joint infection.After bacterial challenge,HBD-3 release was increased approximately five fold in infectious tissues compared with the synovial membranes,and more than 2 times compared with the non-infectious interfacial membranes by ELISA analysis.Immunohistochemistry revealed the staining intensity of HBD-3 localized in fibroblasts and osteocytes in inflamed interfacial membranes significantly higher than not inflamed interface membranes.In case of bacterial colonization with staphylococcus,an significant increase in HBD-3 expression compared with not inflamed tissues by Western blot.Conclusion In the study,the significant difference of the expression of HBD-3 which has been found between inflamed interfacial membranes and not inflamed interfacial membranes.In the future,a feasible application of HBD-3 may even help doctors make a distinction between periprostheticjoint infection and aseptic loosening by intraoperative histological biopsy of the interfacial membranes.

-defensin;Bone infection;Drug-resistant staphylococcus;Implant

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.02.003

swgk2015-12-00256

朱晨（1979-）男，博士，博士后在讀，副主任醫(yī)師。研究方向：關(guān)節(jié)外科、關(guān)節(jié)鏡外科。

*[通訊作者]方詩元（1964-）男，碩士，教授，主任醫(yī)師。研究方向：創(chuàng)傷、脊柱外科。

2015-12-18）

國家自然科學基金（No 81401815），中國博士后科學基金（No 2015M582900），江蘇省博士后科學基金（No 1501146C）

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院1骨一科；3超聲科；4中心實驗室，安徽合肥230001；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院骨科，江蘇 南京210002