李璐，陳群蓉，紀(jì)玲

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518035；2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院輸血科，廣東 深圳 518101)

慢性心力衰竭患者血漿miRNA表達(dá)譜分析

李璐1，陳群蓉2，紀(jì)玲1

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518035；2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院輸血科，廣東 深圳 518101)

目的 對慢性心力衰竭(CHF)患者的血漿miRNA進(jìn)行二代測序，探討CHF患者血漿中miRNA的表達(dá)差異。方法 收集2013年7月至2015年6月間在北京大學(xué)深圳醫(yī)院治療的40例CHF患者和10例健康對照個體，應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)對其血漿miRNA進(jìn)行測序，尋找差異表達(dá)的miRNA。另收集同期CHF患者和健康對照個體各96例，用逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗證。結(jié)果 與健康對照者相比，高通量測序顯示在CHF患者的血漿中miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p的表達(dá)水平存在顯著上調(diào)，miR-31-5p和miR-5091的表達(dá)水平存在下調(diào)，逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測血漿miRNA的表達(dá)差異與高通量測序的結(jié)果相符。結(jié)論 CHF患者的血漿miRNA與健康個體的表達(dá)譜存在差異，差異表達(dá)的miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p、miR-106a-5p、miR-31-5p和miR-5091或許與CHF的發(fā)生有關(guān)。

慢性心力衰竭；血漿；miRNA；表達(dá)

心力衰竭是心肌損傷引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能改變的綜合征，是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿。隨著人口老齡化，冠心病、高血壓等發(fā)病率的增加，以及心肌梗死救治水平的提升，心力衰竭的發(fā)病率逐漸升高，已成為最重要的心血管疾病[1]。我國2003年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示成人心力衰竭的發(fā)病率為0.9%。心力衰竭患者出現(xiàn)癥狀后，其5年存活率與大多數(shù)惡性腫瘤相似[2]。近年來，心力衰竭的治療有了一些進(jìn)展，但心力衰竭患者的預(yù)后仍無明顯改善，因此早期診斷“前臨床心衰階段”的心力衰竭或許能延長心力衰竭患者存活期[3]。微小RNA (microRNA，miRNA)是一類短的不編碼蛋白的小RNA分子，長為18～22 nt，miRNA分子通過特異識別靶基因的mRNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA可參與調(diào)控眾多的細(xì)胞生物學(xué)功能如增殖、凋亡、分化等[4]。本研究將分析慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)患者血漿中的miRNA表達(dá)譜，探討心力衰竭的血漿分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年7月至2015年6月間在本院住院治療的136例CHF患者，其中男性70例，女性66例，年齡(65.16±14.21)歲。所有患者均做二維超聲心動圖及多普勒超聲、心電圖、生物學(xué)標(biāo)志物、X線胸片、實(shí)驗室相關(guān)檢查，CHF的診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)報道[5]。本研究也選取同期來院體檢的健康個體106例，其中男性56例，女性50例，年齡(61.47±11.34)歲。所有參與研究的患者及健康個體均被告知所研究的內(nèi)容，并同意參與本研究。

1.2 RNA抽提及質(zhì)量鑒定 抽取5 mL外周靜脈血于含EDTA-2K的抗凝管中，4℃3 000 r/min離心10 min分離血漿，分離的血漿再于4℃12 000 r/min離心15 min去除細(xì)胞碎片，然后再將血漿于4℃25 000 r/min離心10 min，以去除附著在細(xì)胞碎片上的核酸。最后于-80℃冰箱凍存血漿。使用Qiagen公司的血漿miRNeasy試劑盒抽提血漿總RNA，具體抽提步驟參見試劑盒說明書。通過實(shí)時熒光定量RT-PCR擴(kuò)增SNORD44引物，鑒定抽提的RNA質(zhì)量。抽提的RNA于-80℃冰箱保存。

1.3 miRNA測序 使用Illumina公司的smRNA標(biāo)本文庫構(gòu)建試劑盒，將40例慢性心力衰竭患者和10例健康對照個體的血漿RNA構(gòu)建成smRNA文庫。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出18～30 nt的片段，然后通過T4 RNA連接酶將片段連接到RNA adaptors上(5'-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC和3'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG)，隨后使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶將連接后的片段逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA片段擴(kuò)增，然后于Illumina Hiseq 2000測序儀上進(jìn)行測序，miRNA測序由深圳華大基因有限公司進(jìn)行。

1.4 資料分析 首先去除測序序列的5'adaptor和3'acceptor序列，同時過濾掉低質(zhì)量和污染序列，剩余合格序列分析長度后通過SOAP 2.0版軟件（http:// soap.genomics.org.cn）作圖到人基因組GRCh37.p5上。沒有堿基錯配的Tag才進(jìn)行分析，與已知miRBase庫匹配的tag識別為已知miRNA，非匹配的tag再與Rfam庫和piRNA庫比對確定其是否為rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、scRNA及piRNA。

1.5 實(shí)時熒光定量RT-PCR分析 為了驗證miRNA測序資料的可靠性，本研究挑選表達(dá)升高和降低的miRNA各一個進(jìn)行部分驗證。驗證對象為非測序的另外96例慢性心力衰竭患者和96例健康個體。使用美國GeneCopoeia公司的All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒和引物進(jìn)行miRNA表達(dá)水平的驗證。在96孔反應(yīng)板中進(jìn)行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)體系成分組成參見試劑盒說明書，每個血漿標(biāo)本進(jìn)行3孔重復(fù)反應(yīng)，取均值。擴(kuò)增儀為羅氏LightCycler 480Ⅱ。PCR擴(kuò)增條件為：首先經(jīng)95℃變性10 min；再進(jìn)行40個擴(kuò)增循環(huán)，每一循環(huán)包括95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s；循環(huán)完成后于72℃再延伸5 min。PCR完成后進(jìn)行熔解曲線分析以監(jiān)測反應(yīng)的特異性。以RNU6-2為內(nèi)參照，計算待測miRNA擴(kuò)增的ΔCt，確定miRNA的相對豐度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 患者和健康個體組miRNA擴(kuò)增的ΔCt值的比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 CHF患者和健康個體的血漿miRNA的表達(dá)譜注：表達(dá)差異判定標(biāo)準(zhǔn)：log2(Y/X)絕對值≥1.0且P值≥0.78。

2.1 CHF患者和健康個體的血漿miRNA存在差異表達(dá) 去除接頭和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，測序長度在18～30 nt之間，大部分為22 nt，這些測序片段可作圖到人基因組、rRNA、tRNA和Rfam數(shù)據(jù)中，共計測到371個已知的血漿miRNA(圖1)。通過比較CHF患者和健康個體的血漿miRNA相對豐度，本研究發(fā)現(xiàn)8個miRNA分子存在表達(dá)差異，其中miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p、miR-184、和miR-106a-5p的表達(dá)水平存在上調(diào)，miR-31-5p和miR-5091的表達(dá)水平存在下調(diào)，見表1。

表1 CHF患者與健康個體差異表達(dá)的血漿miRNA

2.2 差異表達(dá)的血漿miRNA的RT-PCR驗證 本研究選取8個差異表達(dá)的血漿miRNA分子中的miR-651-5p(上調(diào))和miR-5091(下調(diào))進(jìn)行RT-PCR驗證。通過RT-PCR擴(kuò)增，miR-651-5p和miR-5091均成功擴(kuò)出，擴(kuò)增曲線見圖2和圖3。經(jīng)比較，CHF患者的血漿miR-651-5p表達(dá)水平較健康個體上升6.23倍(P＜0.01)，而miR-5091的表達(dá)水平下降3.78倍(P＜0.01）。RT-PCR檢測的2個miRNA分子的差異表達(dá)與高通量miRNA測序結(jié)果相符，初步顯示高通量miRNA測序結(jié)果的可靠性。

圖2 miR-651-5p擴(kuò)增曲線

圖3 miR-5091擴(kuò)增曲線

3 討論

心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一組復(fù)雜臨床綜合征，臨床主要表現(xiàn)為呼吸困難、乏力、液體潴留，它是各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段[6]。根據(jù)心衰發(fā)生、發(fā)展過程，可將之分為前心衰、前臨床心衰、臨床心衰、難治性終末期心衰4個階段。心力衰竭是一種慢性進(jìn)展性疾病，尚無有效治療手段，但可預(yù)防。預(yù)防的重要節(jié)點(diǎn)有：從前心衰到前臨床心衰，從前臨床心衰到臨床心衰，后一節(jié)點(diǎn)的預(yù)防在臨床尤為重要[7]。因此，在臨床若能早期診斷心力衰竭有重要意義。目前臨床通過測定血漿利鈉肽對心力衰竭進(jìn)行輔助診斷和鑒別診斷，但特異性和敏感性不高。

miRNA是內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，它在進(jìn)化上高度保守。miRNA有多種生物學(xué)功能。體外miRNA比mRNA有更好的穩(wěn)定性，體內(nèi)miRNA代謝周期更長，因此更適合作疾病的標(biāo)記物[8]。筆者通過深度測序40例CHF患者和10例健康對照個體的血漿中小RNA，共發(fā)現(xiàn)他們血漿中存在371個已知的血漿miRNA，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)8個miRNA在CHF患者和健康對照個體的血漿中存在表達(dá)水平差異。患者中表達(dá)升高的有miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p。表達(dá)降低的有miR-31-5p和miR-5091。由于RNA深度測序技術(shù)本身的局限性及測序標(biāo)本數(shù)量偏少，筆者選取表達(dá)升高的miR-651-5p和表達(dá)降低的miR-5091為代表，使用實(shí)時熒光定量RT-PCR對深度miRNA測序結(jié)果進(jìn)行部分驗證。驗證結(jié)果與深度miRNA測序結(jié)果相符，提示本研究中高通量測序結(jié)果的可靠性。華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院通過微陣列芯片研究發(fā)現(xiàn)CHF患者血漿中miR-660-3p、miR-665、miR-1285-3p及miR-4491存在表達(dá)升高，該研究沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的miRNA。我們的研究結(jié)果與之不同，可能是所用方法不同導(dǎo)致的。

經(jīng)GO聚類分析，這些差異表達(dá)miRNA的目標(biāo)基因主要功能為抗氧化、結(jié)合蛋白(可結(jié)合蛋白分子、脂類分子及維生素分子)，還有的目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物具有酶分子的催化活性。這些目標(biāo)基因是通過誘發(fā)冠心病、高血壓病、心肌病的發(fā)病進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭，還是直接導(dǎo)致CHF有待進(jìn)一步研究。表達(dá)上調(diào)的miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p能否預(yù)測CHF需擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證。

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Profiling of plasma miRNA in chronic heart failure patients.

LI Lu1,CHEN Qun-rong2,Ji Ling1.1.Department of Clinical Laboratory,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518035,Guangdong,CHINA;2.Department of Blood Transfusion,Shenzhen People's Hospital of Baoan,Shenzhen 518101,Guangdong,CHINA

Objective To search for differentially expressed plasma miRNAs between patients with chronic heart failure(CHF)and healthy controls by next-generation small RNA sequencing.Methods Forty CHF patients and 10 healthy volunteers were recruited to search for differentially expressed plasma miRNAs in next-generation small RNA sequencing study from Peking University Shenzhen Hospital between July 2013 and June 2015.miRNAs expression were validated in another 96 patients and 96 controls by RT-PCR analysis during the same period.Results Comparing to healthy group,miRNA sequencing showed that miR-184,miR-651-5p,miR-130b-5p,miR-203a-3p, miR-548e-3p,and miR-106a-5p were upregulated and miR-31-5p and miR-5091 were downregulated in CHF patients.The levels of miRNA measured by RT-PCR were consistent with the results obtained from miRNA sequencing technology.Conclusion A differentially expressed miRNA profiling was seen between patients and healthy individuals. The miR-184,miR-651-5p,miR-130b-5p,miR-203a-3p,miR-548e-3p,miR-106a-5p,miR-31-5p,and miR-5091 may be closely involved in the pathogenesis of chronic heart failure.

Chronic heart failure;Plasma;miRNA;Expression

R541.6

A

1003—6350（2016）15—2438—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.009

2016-02-04)

李璐。E-mail:31656416@qq.com