劉煒楓，趙帥，陳伯鈞，張烈元，蔡海榮，唐詠，曾靖

(1.廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 佛山 528200；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405)

LXR mRNA在動脈粥樣硬化兔中的表達變化

劉煒楓1，趙帥2，陳伯鈞2，張烈元2，蔡海榮2，唐詠2，曾靖2

(1.廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 佛山 528200；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405)

目的 觀察LXR mRNA在動脈粥樣硬化(AS)兔不同時段的表達，探討LXR對AS的影響。方法 采用隨機對照研究的方法將20只健康雄性新西蘭兔分為對照組和AS組，各10只，對照組予普通飼養(yǎng)，AS組予高脂飼養(yǎng)并注射牛血清白蛋白。分別在第1周和第8周檢測兩組兔子膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、LXR mRNA及髂外動脈組織電鏡檢測。結果 血脂方面，第1周，AS組TC升高，HDL-C降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；第8周，AS組TC、LDL-C均升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；髂外動脈內膜形態(tài)學方面，AS組第1周和對照組第1、8周肉眼觀察0級。第8周AS組肉眼觀察0.5級；髂外動脈內膜組織電鏡檢測方面，AS組第1周和對照組第1、8周未見明顯病理改變。AS組第8周可見平滑肌細胞中充滿了大量脂滴小泡，胞漿中可見膽固醇結晶樣物質、密體和線粒體等結構；LXR mRNA表達方面，第1周，LXRα mRNA組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；第8周，AS組LXRα mRNA升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論 LXRα mRNA表達升高可能是一種改善動脈粥樣硬化早期的代償調節(jié)機制。

LXR mRNA；膽固醇；甘油三酯；動脈粥樣硬化；兔子；電鏡檢測

動脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)是一種慢性動脈疾病，具有很高的發(fā)病率和死亡率，可引起冠心病和腦卒中等，對人類生命健康構成極大威脅。肝臟、肌肉、小腸以及脂肪組織等部位對糖脂的吸收轉運利用和糖皮質激素代謝的調節(jié)[1-3]，有一部分是通過核受體超家族成員肝X受體(LXRs)與膽固醇結合后，激活下游SREBP1c、GLUT、UCP-1、載脂蛋白等而實現(xiàn)的[4]。本研究通過制備家兔AS模型，檢測肝X受體的表達，分析肝X受體與AS早期變化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選用3個月齡健康雄性新西蘭兔(廣州花都區(qū)花東信華實驗動物有限公司提供)20只，體質量(2.5±0.5)kg。采用隨機對照研究的方法將兔子分為對照組和動脈粥樣硬化組(AS組)，各10只。

1.2 動物喂養(yǎng) 在廣東省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心喂養(yǎng)(每籠1只)。(1)飼養(yǎng)條件：室溫(22±4)℃，相對濕度(58±6)%，白天與黑夜環(huán)境由光線模擬生成，循環(huán)時間為12 h。適應性飼養(yǎng)10 d。之后對照組普通飲食，AS組高脂飲食。飼料真空包裝，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。(2)普通飼料配方：碳水化合物68%、蛋白22%、食鹽0.5%、脂肪10%。(3)高脂飼料配方：84%基礎飼料、10%蛋黃粉、4%豬油和2%膽固醇。

1.3 動脈粥樣硬化動物造模 采用免疫性內皮損傷合并高脂飼料誘導，造模第1天對照組一次性耳緣靜脈注射250 mg/kg的生理鹽水，AS組一次性耳緣靜脈注射牛血清白蛋白250 mg/kg。各組動物每日進食總量相等，每日100 g，分兩次，每12 h一次。觀察8周，每周測體質量1次。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 生化指標 兔子禁食12 h后，經(jīng)耳緣靜脈抽血，在冰箱靜置，時間0.5 h，溫度：4℃。之后離心，轉速：3 000 r/min。通過生化分析儀(羅氏Co-bas8000)測定血脂四項(TC、TG、LDL-C、HDL-C)。

1.4.2 形態(tài)學觀察 實驗結束后解剖，對髂外動脈壁病變進行肉眼觀察分級[5]?？偣灿?級。內膜比較光滑代表0級；內膜有廣泛奶油樣變化代表0.5級；內膜有明顯的凸起但面積小于3 mm2的奶油樣斑塊代表1級；如果斑塊面積超過3 mm2代表2級；如果大部分斑塊面積超過3 mm2代表3級；如果斑塊基本覆蓋動脈內膜代表4級。

1.4.3 組織電鏡檢測 在1、8周末，超聲檢查后，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死兔子，取2 cm左髂外動脈，戊二醛磷酸緩沖液固定，時間不超過3 d，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗，用1%鋨酸加0.8%Fe(CN)6固定30 min，再經(jīng)磷酸緩沖液沖洗，丙酮行梯度脫水，用Epon812包埋，在60℃聚合24 h。首先，用光鏡觀察制成半薄切片的血管內膜。然后在有支持膜的銅網(wǎng)上放置70～80 nm的超薄切片，先后用5%的水性醋酸鈾和枸櫞酸染色染色，時間分別為10 min和5 min，最后用透射電鏡觀察及拍照。電鏡型號：JEM-2000EX型。

1.4.4 LXRmRNA檢測 通過實時熒光定量PCR的方法檢測。采用Trizol一步法提取總RNA，反轉錄成cDNA(反轉錄酶：SSⅢ，Invitrogen公司)，引物設計如下。反應條件：95℃10 s，60℃30 s，70℃30 s，共40個循環(huán)，Ct值取循環(huán)閾值均值?！鰿t=每組目的基因表達均值-內參均值。LXR-β引物，上游5'-ACAGCCAGACGCTACAACCA-3'，下游5'-GGCA ATGAGCAAGGCATACTC-3'；LXR-α引物，5'-GGAA CGAGCTATGCAGTGTATGTG-3'，下游5'-CCACCGCTATGGCAAATGT-3'。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布或方差不齊者組間比較采用非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠體質量比較 1周末[(264.60±0.05)g vs(255.80±0.23)g，t=-0.838]和8周末[(329.20±0.51)g vs(328.60±0.18)g，t=-0.025]兩組兔子體質量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 兩組大鼠代謝性指標比較 第1周，兩組兔子的TC、HDL-C組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，AS組較對照組升高，見表1；第8周，兩組大鼠的TC、LDL-C組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，AS組較對照組升高，見表2。

表1 第1周兩組兔子代謝性指標比較(mmol/L，±s)

表1 第1周兩組兔子代謝性指標比較(mmol/L，±s)

組別TC TG HDL-C LDL-C AS組(n=5)對照組(n=5) t值P值1.66±0.56 0.44±0.20 -4.559 0.002 0.35±0.22 0.51±0.32 0.912 0.388 0.43±0.14 0.08±0.14 -3.946 0.004 0.93±0.55 1.09±0.13 0.656 0.544

表2 第8周兩組兔子代謝性指標比較(mmol/L，±s)

表2 第8周兩組兔子代謝性指標比較(mmol/L，±s)

組別TC TG HDL-C LDL-C AS組(n=5)對照組(n=5) t值P值11.84±2.17 1.33±0.18 -10.794 0.000 3.74±4.92 0.70±0.20 -1.379 0.240 0.50±0.48 0.36±0.28 -5.550 0.597 11.39±3.49 0.71±0.36 -6.812 0.002

2.3 兩組兔子形態(tài)學比較 AS組第1周和對照組第1、8周髂外動脈肉眼觀察0級。第8周AS組髂外動脈肉眼觀察0.5級。

2.4 兩組兔子組織電鏡檢測結果比較 1周后，對照組可見一平滑肌細胞，細胞核呈長條形，胞漿中可見密體和線粒體等結構，未見明顯病理改變。AS組可見平滑肌細胞，細胞核外形不規(guī)則，核中常染色質較多，異染色質較少聚集在核內膜下，細胞漿中可見密體等結構，細胞之間聯(lián)系緊密，見圖1。8周后，對照組可見橫切的平滑肌細胞，細胞核呈橢圓形，胞漿中可見密體和線粒體等結構，未見明顯病理改變。AS組可見平滑肌細胞中充滿了大量脂滴小泡，胞漿中可見膽固醇結晶樣物質，胞漿中可見密體和線粒體等結構，細胞核不規(guī)則，表面有切跡，核中常染色質較多，異染色質較少，見圖2。

2.5 兩組兔子LXRα和LXRβ mRNA的表達比較 第1周，LXRα和LXRβ mRNA表達組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3；第8周，LXRα mRNA表達組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，LXRβ mRNA表達組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，AS組LXRα mRNA表達較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

圖1 1周內皮電鏡檢測

圖2 8周內皮電鏡檢測

表3 第1周兩組LXRα和LXRβ mRNA的表達比較

表4 第8周兩組LXRα和LXRβ mRNA的表達比較

3 討論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病早期的重要病理改變。既往研究發(fā)現(xiàn)LXR在膽固醇、脂肪代謝以及抗動脈粥樣硬化中有重要的作用，是研究的重要靶點。國內研究提示：采用本次實驗造模方法可成功培養(yǎng)出兔動脈粥樣硬化模型。劉俊等[6]在對家兔注射250 mg/kg牛血清白蛋白后配合4周的高脂飲食，可培養(yǎng)出動脈粥樣硬化模型。傅曉東等[7]則在兔去勢后的1周、5周、9周，靜脈注射250 mg/kg小牛血清白蛋白，在3個月后培養(yǎng)出兔絕經(jīng)后動脈粥樣硬化模型。本次實驗在造模第8周可見實驗組TC、LDL-C明顯升高；髂外動脈肉眼觀察0.5級；髂外動脈電鏡觀察可見平滑肌細胞中充滿了大量脂滴小泡，胞漿中可見膽固醇結晶樣物質。參照模型標準，本實驗動脈粥樣硬化的造模方法是可行的。

通過分析動脈粥樣硬化兔各指標不同時段的結果，本研究發(fā)現(xiàn)：在實驗開始階段，體質量組間差異無統(tǒng)計學意義。隨著實驗進程，各組動物體質量隨時間變化呈上升趨勢，但在飼養(yǎng)第8周時，體質量組間差異不顯著，說明體質量不影響觀察指標的組間比較。而在LXR mRNA的表達方面發(fā)現(xiàn)，第8周結果顯示LXRα mRNA在AS組兔子中表達升高。而膽固醇在LXRs的作用下可逆向轉運[8]。LXRs激動劑抗動脈粥樣硬化是通過加強膽固醇的逆向轉運和降低血管壁巨噬細胞的炎癥反應而實現(xiàn)的[9-11]。因此LXRα表達升高可能是一種改善動脈粥樣硬化早期的代償調節(jié)機理。隨著后期進一步發(fā)展，LXRα的變化機制值得進一步深入研究。

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[5]張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法[M].北京:北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,1998:1263-1271.

[6]劉俊,石興明,程大軍,等.川芎總苯酞對家兔動脈粥樣硬化的影響[J].中國藥物應用和監(jiān)測,2002,17(5):10-11.

[7]傅曉東,何春燕,陳偉華,等.補腎法對去勢兔動脈粥樣硬化血清性激素水平及主動脈血管壁雌激素-β受體表達的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2005,3(1):31-33.

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Expression changes of LXR mRNA in atherosclerosis rabbits.

LIU Wei-feng1,ZHAO Shuai2,CHEN Bo-jun2, ZHANG Lie-yuan2,CAI Hai-rong2,TANG Yong2,ZENG Jing2.1.Intensive Care Unit,Guangdong Province Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine,Foshan 528200,Guangdong,CHINA;2.The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA

Objective To observe the expression of LXR mRNA in different stage of the atherosclerosis rabbits,and investigate the effect of LXR on atherosclerosis.Methods Using randomized controlled method,20 healthy New Zealand male rabbits were equally allocated into control group and atherosclerosis(AS)group.The control group rabbits were fed with common diet,and the AS group rabbits were fed with a high fat diet and injected with bovine serum albumin.Cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein(LDL-C),high density lipoprotein(HDL-C), LXR mRNA and electron microscopic observation of external iliac artery in the two groups at the first and the 8thweek were detected.Results For blood lipid:At the first week,the TC significantly increased(P＜0.05)and HDL-C significantly reduced(P＜0.05)in AS group;At the 8thweek,the TC and LDL-C significantly increased(P＜0.05)in AS group. In morphology of external iliac artery intima,macroscopic observation at the first week of both groups and the 8thweek of the control group were level 0,but level 0.5 at the 8thweek in AS group.In electron microscope inspection,there were no obvious pathological changes at the first week of both groups and the 8thweek in the control group.At the 8thweek,a large amount of fat drops of vesicles,cholesterol crystal sample material,and dense body and mitochondria structure, etc.were visible in the smooth muscle cells in AS group.For LXR mRNA:At the first week,there was no difference between two groups in the expression of LXRα mRNA(P＞0.05),while at the 8thweek,the expression of LXRα mRNA in the AS group significantly increased(P＜0.05).Conclusion Increased expression of LXRα mRNA may be a compensatory adjustment mechanism to improveAS in the early stage.

LXR mRNA;Cholesterol;Triglyceride;Atherosclerosis;Rabbits;Electron microscopy

R-332

A

1003—6350（2016）15—2413—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.002

2016-03-01)

國家自然科學基金委員會資助青年基金項目（編號：81303117）

曾靖。E-mail：13650978694@193.com