董曉琳，李志萍，陳　漫，樊洪超，王園園，夏志平，吳永魁

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130122)

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液相適配體芯片在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

董曉琳，李志萍，陳漫，樊洪超，王園園，夏志平*，吳永魁*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130122)

食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，對食源性致病菌的快速和高通量檢測是防止和診斷細(xì)菌性食物中毒的有效手段。液相芯片檢測技術(shù)具有需樣本量少、高通量等特點(diǎn)。經(jīng)典液相芯片技術(shù)是以有機(jī)熒光染料編碼的聚苯乙烯微球?yàn)檩d體，新型液相芯片技術(shù)是以物理學(xué)、光學(xué)等編碼的基質(zhì)為載體，通過制備不同配體功能化的載體，實(shí)現(xiàn)對同一液相環(huán)境中多種靶細(xì)菌的同時(shí)檢測。適配體是一類相比蛋白類抗體特異性高、篩選獲得快、化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)的核酸配體。論文針對核酸適配體分析鑒及以適配體為基礎(chǔ)的新型液相芯片技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

適配體；液相芯片；食源性致病菌；檢測

近年來，食品安全問題越來越受到人們的關(guān)注，其中由病原微生物引起的食源性疾病是食品安全中最重要的問題。因此，快速檢測食源性致病菌是有效地控制和預(yù)防病原菌傳播和食物中毒的重要前提。傳統(tǒng)檢測方法特異性好、靈敏度高，但往往只能針對一種細(xì)菌且所需時(shí)較長(3 d～7 d)。PCR檢測方法速度快、特異性好，但易受食品中復(fù)雜基質(zhì)的影響，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)，需樣本量大[1]、檢測限較高。為解決這些檢測方法的劣勢，液相芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。液相芯片技術(shù)具有高通量、靈活性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)勢，現(xiàn)在已發(fā)展并運(yùn)用于多種病原微生物[2]、毒素[3]和細(xì)胞因子的檢測。

液相芯片，又稱為懸浮陣列，是將探針分子固定于不同編碼微載體的表面，在液相環(huán)境中，每種功能化的編碼載體結(jié)合特定的識別分子，再加入熒光標(biāo)記的報(bào)告分子，通過懸浮液態(tài)體系中進(jìn)行的生物反應(yīng)，解碼功能化載體的編碼，識別每種結(jié)合反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)高通量生物分子的檢測技術(shù)。液相芯片技術(shù)包括液相蛋白芯片技術(shù)和液相核酸芯片技術(shù)。經(jīng)典液相核酸芯片技術(shù)與多重(熒光)PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于多種致病菌和病毒的檢測。針對多種病原菌的16 S rDNA、23 S rDNA或者細(xì)菌的特征性侵襲基因進(jìn)行多重(熒光)PCR，將不同的基因特異性探針偶聯(lián)于具有熒光編碼的微球上，通過基因雜交實(shí)現(xiàn)對病原菌的檢測。郭啟新等[4]針對金黃色葡萄球菌23 S rDNA、志賀菌iapH、單核細(xì)胞增生李氏桿菌iap基因分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種多重PCR與液相芯片技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的檢測方法，檢測結(jié)果顯示偶聯(lián)有探針的微球只與其對應(yīng)的病原菌基因發(fā)生反應(yīng)，特異性較高。液相芯片技術(shù)多用于蛋白、核酸等小分子的檢測。近年來，也有研究應(yīng)用液相蛋白芯片技術(shù)檢測病原菌(大分子)。通過制備抗體功能化微球，將其與目標(biāo)菌孵育結(jié)合后，加入修飾有熒光標(biāo)簽的檢測抗體，最后分析報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)菌的檢測[5-6]。

經(jīng)典液相芯片技術(shù)來源于Luminex和BD公司，其核心技術(shù)是使用有機(jī)熒光染料編碼的微載體去識別不同的生物分子。目前報(bào)道了許多微球的編碼技術(shù)，包括光學(xué)編碼、物理編碼(如以熒光壽命編碼[7]、載體大小編碼[8])、化學(xué)編碼和電學(xué)編碼。不同編碼技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用產(chǎn)生了更多種類編碼的微載體[9]，進(jìn)而衍生出很多新型的液相芯片檢測手段。新型液相芯片技術(shù)突破了僅且只能依靠流式細(xì)胞儀對載體和報(bào)告分子進(jìn)行解碼和分析的技術(shù)限制，使得解碼設(shè)備更加多樣，報(bào)告分子的選擇更加豐富。

適配體于1990年首次報(bào)道[10]，是一類短的單鏈寡核苷酸，可以通過體外篩選得到，其折疊形成的空間構(gòu)象可以高親和力、特異性的與蛋白質(zhì)、小分子和細(xì)菌結(jié)合[2-4]。適配體相比抗體而言，具有許多優(yōu)勢，其制備過程簡單，不易受環(huán)境影響(pH、溫度、化學(xué)試劑)，能經(jīng)受構(gòu)象的改變再次使用，易于保存和修飾，從而便于結(jié)合其他電化學(xué)或光學(xué)方法進(jìn)行微生物檢測、藥物治療等[11-13]。

近年來，以適配體為基礎(chǔ)構(gòu)建新型液相芯片技術(shù)，已逐步引起研究學(xué)者的關(guān)注。論文就適配體的特異性、親和力鑒定方法，以及基于幾種常見的光學(xué)編碼的液相芯片檢測方法做一綜述。

1　適配體篩選與鑒定

1.1核酸適配體

核酸適配體是由指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選獲得。首先體外合成一單鏈寡核苷酸庫(ssDNA或ssRNA)，文庫兩端為固定堿基序列，中間為隨機(jī)序列，庫容量約為1020～1030。將該隨機(jī)文庫與靶物質(zhì)混合孵育后，通過離心或者其他技術(shù)手段分離得到核酸與靶物質(zhì)的復(fù)合物，將此核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行下一輪篩選，一般通過8輪～15輪的篩選和擴(kuò)增獲得候選適配體序列，最后通過生物信息學(xué)分析、親和力測定獲得一條或者幾條能高特異性、高親和力結(jié)合靶物質(zhì)的適配體。

1.2核酸適配體鑒定

核酸適配體鑒定研究是獲得高親和力、高特異性適配體的關(guān)鍵，通過對每輪的核酸序列親和力測定以確定最佳篩選輪數(shù)，監(jiān)測篩選過程，減少不必要的篩選時(shí)間和人力。對適配體候選序列進(jìn)行親和力測定，最終確定一條或幾條高特異性、高親和力適配體。

由完整細(xì)胞為靶分子進(jìn)行的親和力測定方法包括流式細(xì)胞術(shù)測定法、熒光定量PCR[14]、放射性同位素標(biāo)記法[15]等。除此之外，還有一些新的親和力測定技術(shù)如毛細(xì)管電泳技術(shù)等可用于評估微生物或蛋白與適配體候選序列的親和力。

流式細(xì)胞術(shù)是分析細(xì)胞與適配體候選序列親和力的常用手段，通過在適配體候選序列的一端標(biāo)記熒光分子，然后與細(xì)胞孵育、洗滌后分析單個(gè)細(xì)胞，通過計(jì)算結(jié)合上標(biāo)記熒光適配體的細(xì)胞陽性率來評估候選序列與靶細(xì)胞的結(jié)合力，從而監(jiān)測整個(gè)篩選過程。Moon J等[16]利用FACS-SELEX(fluorescence activated cell sorting)，經(jīng)過10輪篩選獲得了針對金黃色葡萄球菌高親和力與特異性適配體A14，并使用流式細(xì)胞術(shù)測定，其解離常數(shù)為3.49 nM±1.43 nM。

親和毛細(xì)管電泳是根據(jù)靶分子和配體的濃度變化及靶分子-配體復(fù)合物的遷移率變化表征復(fù)合物的形成或解離。以aptamer為親和探針，利用其與靶分子在電泳前或電泳過程中的親和作用，可定量分析靶分子以及測定親和常數(shù)。自從German I等[17]將毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用于適配體與其靶分子的親和力研究以后，在世界范圍內(nèi)掀起了一股CE-SELEX(capillary electrophoresis，CE)的研究熱潮，但是關(guān)于利用毛細(xì)管電泳技術(shù)測定完整細(xì)菌分子與適配體親和力方面的報(bào)道很少。Stratis-Cullum D N等[18]首次使用毛細(xì)管電泳評估空腸彎曲菌適配體的特異性和親和性，并證明該適配體與其他食源性致病菌如鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌O157:H7沒有明顯的位移和峰型變化。

2　基于適配體構(gòu)建的新型液相芯片檢測方法

2.1以量子點(diǎn)編碼載體為基礎(chǔ)的液相芯片技術(shù)

量子點(diǎn)(quantum dot，QD)是由有限數(shù)目的半導(dǎo)體材料(通常由ⅡB～ⅥB或ⅢB～ⅤB元素組成)制成，量子點(diǎn)的典型尺寸在10 nm～50 nm之間。量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)特性，具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，可以在小于其發(fā)射波長的任何波長下被激發(fā)，且發(fā)射波長范圍極短(半峰寬約為20 nm～30 nm)，發(fā)射峰對稱。在同一波長下激發(fā)多個(gè)量子點(diǎn)，得到多個(gè)不同發(fā)射峰的量子點(diǎn)的譜帶，基于量子點(diǎn)的不同熒光顏色和熒光強(qiáng)度進(jìn)行熒光編碼，從而可以作為多色標(biāo)記物應(yīng)用于多組分的分析研究。將不同靶物質(zhì)的特異性配體偶聯(lián)于不同熒光顏色的量子點(diǎn)表面，可實(shí)現(xiàn)同一液相環(huán)境中多種病原菌的檢測。Duan N等[19]將鼠傷寒沙門菌適配體和副溶血性弧菌適配體分別固定于發(fā)射波長為535 nm和585 nm的量子點(diǎn)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測綠色熒光通道和橙色熒光通道的陽性區(qū)域的細(xì)菌數(shù)百分比，實(shí)現(xiàn)同時(shí)識別副溶性血弧菌和鼠傷寒沙門菌的目的，檢測特異性高且結(jié)果可靠。量子點(diǎn)編碼的載體易被流式細(xì)胞儀或者熒光分光光度計(jì)解碼。由于流式細(xì)胞儀也可根據(jù)微載體大小進(jìn)行解碼，許多學(xué)者通過將不同熒光顏色和熒光強(qiáng)度編碼的量子點(diǎn)與不同大小的微球結(jié)合，從而產(chǎn)生更多的編碼。在流式細(xì)胞儀的分析圖FLn-FLm-FS(n和m分別表示不同的熒光通道)將會生成一種三維空間的編碼庫。

2.2以上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒為基礎(chǔ)的液相芯片技術(shù)

上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(upconversion fluorescent nanoparticles，UCNPs)一般是通過在基質(zhì)(一般為氟化物)中摻入稀土離子(發(fā)光離子)和敏化離子(提高上轉(zhuǎn)換效率)形成。上轉(zhuǎn)換納米材料由近紅外線(near infrared ray，NIR)波長激發(fā)(一般為980 nm)，發(fā)射出短波長、高頻率的光。UCNPs發(fā)射譜帶窄，通過摻入鑭系元素的比例不同(Er3+、Tm3+、Ho3+)，調(diào)節(jié)發(fā)射的熒光顏色。除此之外，上轉(zhuǎn)換納米顆粒之間不會產(chǎn)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，是作為微球編碼的最佳熒光物質(zhì)。Wu S等[20]通過摻入不同的稀土離子分別制備了3種不同熒光發(fā)射峰的UNCPs，將金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門菌適配體偶聯(lián)于多色UNCPs作為分子識別配件，與偶聯(lián)適配體互補(bǔ)序列的磁珠結(jié)合后，檢測目標(biāo)細(xì)菌。當(dāng)樣本體系中含有目標(biāo)細(xì)菌時(shí)，功能化UNCPs特異性捕獲靶細(xì)菌，從互補(bǔ)序列的磁珠上解離下來，使用980 nm激光器解碼分析磁珠上的UNCPs發(fā)射峰和強(qiáng)度，進(jìn)而達(dá)到鑒別細(xì)菌的目的。

2.3以SERS光學(xué)編碼載體為基礎(chǔ)的液相芯片技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼(surface enhanced raman scattering，SERS)是一個(gè)通過依賴生物成像產(chǎn)生光學(xué)信號，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測的生物傳感器，主要依靠等離子共振材料，比如重金屬(銀、金、銅)等具有納米特性的物質(zhì)(粗糙的表面和納米顆粒)實(shí)現(xiàn)拉曼光譜的增強(qiáng)。在先前的報(bào)道中，一些納米材料，如石墨烯、TiO2、QDs均具有SERS特性。在液相芯片技術(shù)中，SERS信號分子通常作為一種標(biāo)記分子修飾在微載體上。2007年，Doering W E等[21]推出Nanoplex技術(shù)，NanoplexTMbiotag是將標(biāo)記有拉曼信號分子的納米顆粒包裹于二氧化硅殼之下，拉曼信號分子的拉曼峰作為一種編碼，廣泛應(yīng)用于多種檢測實(shí)驗(yàn)中。Zhang H等[22]將金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌的特異性適配體分別結(jié)合在修飾有拉曼信號分子5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB]和對巰基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)納米金表面，并制備兩種適配體共同功能化的Fe3O4@Ag 納米顆粒，將功能化的納米金顆粒、Fe3O4@Ag 納米顆粒與靶細(xì)菌共同孵育結(jié)合，磁性分離后，利用拉曼光譜儀分析DNTB和MBA的拉曼信號，實(shí)現(xiàn)液相環(huán)境中細(xì)菌的雙重檢測。

2.4其他

隨著液相芯片技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，許多學(xué)者將微載體的合成及修飾作為構(gòu)建多重生物分子檢測技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。Ye B F等[23]通過制備不同形狀、不同結(jié)構(gòu)色的水凝膠晶體，構(gòu)建了以適配體為基礎(chǔ)的新型多重檢測技術(shù)，研究中發(fā)現(xiàn)由于光子晶體自身結(jié)構(gòu)形成的多個(gè)表面空隙導(dǎo)致強(qiáng)烈的非特異性吸附，利用瓊脂糖凝膠具有良好的生物相容性這一特征，將其包裹于光子晶體表面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這樣可以有效封堵微球空隙，提高了功能化光子晶體與靶物質(zhì)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。Wang L等[24]構(gòu)建食源性致病菌的多重檢測方法時(shí)，將聚乙二醇修飾于磁珠表面，通過增加磁珠的水溶性和增長抗體與磁珠之間的距離從而降低位阻效應(yīng)，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，并且研究發(fā)現(xiàn)直接將抗體偶聯(lián)于磁珠表面不能較好的檢測細(xì)菌。此外，制定不同模式的信號擴(kuò)增法提高多重檢測系統(tǒng)的靈敏度、建立以磁性微載體為基礎(chǔ)的自動(dòng)化多重檢測平臺等正不斷促進(jìn)液相芯片技術(shù)的發(fā)展。

3　小結(jié)和展望

液相芯片以其操作簡便、高靈敏度、高通量以及寬的線性測定范圍等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。經(jīng)典液相芯片技術(shù)利用流式細(xì)胞術(shù)解析熒光編碼的微球，分析報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的定性和定量分析。新型液相芯片技術(shù)的出現(xiàn)，打破了僅依靠流式細(xì)胞儀分析鑒定的局限，但所需分析設(shè)備存在解碼速度慢、價(jià)格昂貴、需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)。在經(jīng)典的多重檢測技術(shù)中，生物標(biāo)簽、分析物和偶聯(lián)有捕獲配體的微載體組成類似夾心酶聯(lián)免疫試驗(yàn)的復(fù)合物，通過分析微載體和生物標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)檢測。新型液相芯片技術(shù)通常包括偶聯(lián)有生物標(biāo)簽的捕獲配體和分析物，通過使用相關(guān)儀器對生物標(biāo)簽進(jìn)行分析、解碼，便可實(shí)現(xiàn)分析物的檢測。方法更加便捷、快速，但對捕獲配體的特異性、親和力要求更加苛刻。此外，構(gòu)建多重液相芯片檢測手段時(shí)，還需要花費(fèi)大量的時(shí)間和勞動(dòng)力，進(jìn)行配體篩選和功能化載體特異性鑒定工作，以保證功能化載體之間互不干擾，無交叉反應(yīng)，結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠。因此，在構(gòu)建以適配體為基礎(chǔ)液相芯片檢測技術(shù)時(shí)，制定高效率的篩選方法、鑒定手段，獲得更多種類的高特異性適配體具有重要意義。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過對適配體篩選技術(shù)及鑒定技術(shù)的不斷優(yōu)化，液相芯片技術(shù)研究的不斷深入，以適配體為基礎(chǔ)構(gòu)建的液相芯片檢測平臺將在食源性致病菌檢測領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

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Application of Aptamer-based Suspension Array in Detection of Food-borne Pathogens

DONG Xiao-lin,LI Zhi-ping,CHEN Man,FAN Hong-chao,WANG Yuan-yuan,XIA Zhi-ping,WU Yong-kui

(Institute of Veterinary Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Key Laboratory of Jilin Province forZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin,130122,China)

Food-borne pathogens are important factors to cause food poisoning,rapid detection of food-borne pathogens are effective means of prevention and diagnosis of bacterial food poisoning.Suspension array technology is a fast,high-throughput detection method.Classic liquid chip technology is based on the organic fluorescent dye-coded polystyrene microspheres as a carrier,while the new-type suspension array technology is based on physics and optical coding matrix as the carrier,through preparing several different ligands functionalized carriers,the multiplex detections of target bacteria in one liquid environment were achieved.Aptamer have many advantages over antibody in aspects of specificity,rapid screening progress and strong chemical stability.In this article,aptamers identification methods and applications of aptamer-based chip technology in food-borne pathogen detection were reviewed.

aptamer;suspension array;food-borne pathogens;detection

2016-02-29

武漢東湖新技術(shù)開發(fā)區(qū)3551光谷人才計(jì)劃(第7批)

董曉琳(1990-)，女，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.61

A

1007-5038(2016)08-0104-04