王英賀，曹利利，姚新華，苑淑賢，郭衍冰，宮鵬濤，丁　鶴，董　航，魏　峰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春 130062；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062)

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文獻(xiàn)綜述

弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白研究進(jìn)展

王英賀1,2，曹利利2，姚新華2，苑淑賢2，郭衍冰2，宮鵬濤3，丁鶴3，董航2，魏峰1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春 130062；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062)

弓形蟲(chóng)是一種胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，由其引發(fā)的人獸共患病給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了威脅。弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白是弓形蟲(chóng)致密顆粒細(xì)胞器分泌的一類(lèi)免疫活性蛋白，與蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)寄生、發(fā)育密切相關(guān)，是重要的弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原分子。論文將近年來(lái)在致密顆粒蛋白方面的研究發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展進(jìn)行闡述，為今后的深入研究提供參考。

弓形蟲(chóng)；致密顆粒蛋白；免疫活性蛋白

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)為原生動(dòng)物門(mén)、孢子蟲(chóng)綱、真球蟲(chóng)目、肉孢子蟲(chóng)科、弓形蟲(chóng)屬，1908年由法國(guó)學(xué)者Nicolle和Manceaux在嚙齒動(dòng)物肝臟和脾臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]。弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性寄生在多種哺乳動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)的機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，其生活史復(fù)雜，呈世界性分布[2]。由弓形蟲(chóng)引發(fā)的疾病給人類(lèi)的健康以及畜牧生產(chǎn)帶來(lái)的危害極大[3]，我國(guó)已于1999年將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病[4]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為多種動(dòng)物共患傳染病。弓形蟲(chóng)抗原蛋白種類(lèi)多，但是較為重要的為膜表面蛋白(surface antigen,SAGs)、微線體蛋白(microneme proteins,MICs)、棒狀體蛋白(rhoptry proteins,ROPs)和致密顆粒蛋白(dense granules antigen,GRAs)，弓形蟲(chóng)能侵入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖離不開(kāi)這些蛋白的相互作用。近年來(lái)研究表明GRAs是保證弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的蛋白， 同時(shí)也是抗弓形蟲(chóng)病的疫苗候選分子。GRAs是由致密顆粒細(xì)胞器分泌的一類(lèi)免疫活性蛋白且均為分泌性抗原，不在入侵過(guò)程中起作用，在侵入宿主細(xì)胞20 min左右其分泌量達(dá)到高峰。當(dāng)GRAs被分泌入納蟲(chóng)空泡(parasitophorous vacuode，PV)后，大部分蛋白均結(jié)合于納蟲(chóng)泡膜(parasitophorous vacuode membrane，PVM)上。GRAs可以抵抗宿主細(xì)胞溶酶體對(duì)弓形蟲(chóng)進(jìn)行的攻擊，保證了弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)育，同時(shí)因其具有較強(qiáng)的免疫原性，在弓形蟲(chóng)病診斷與檢測(cè)中有重要作用。本文將近年來(lái)對(duì)致密顆粒蛋白的研究發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展做一綜述，希望為今后的相關(guān)研究提供參考。

1　弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白的發(fā)現(xiàn)和命名

20世紀(jì)60年代，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察弓形蟲(chóng)細(xì)胞器內(nèi)部時(shí)，發(fā)現(xiàn)的直徑約為200 nm的致密小體，這類(lèi)致密小體的數(shù)量因弓形蟲(chóng)所處的不同階段而有所不同，其中在弓形蟲(chóng)的速殖子階段最為普遍。隨著越來(lái)越多的特征蛋白被發(fā)現(xiàn)，1991年Sibley等[5]提出了剛地弓形蟲(chóng)基因和蛋白的統(tǒng)一命名法，該命名法起源于酵母。

2　弓形蟲(chóng)入侵宿主的過(guò)程

通過(guò)研發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制相對(duì)保守，弓形蟲(chóng)黏附并侵入宿主細(xì)胞主要是通過(guò)微線體、棒狀體和致密顆粒等的協(xié)同作用。當(dāng)弓形蟲(chóng)速殖子頂端與宿主細(xì)胞表面接觸時(shí)，弓形蟲(chóng)頂端的亞細(xì)胞器分泌MICs和ROPs來(lái)對(duì)宿主細(xì)胞膜上的受體進(jìn)行分析識(shí)別后黏附于宿主細(xì)胞膜。在與宿主細(xì)胞之間的連接處，蟲(chóng)體依靠其原生質(zhì)膜下的“肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白”的運(yùn)動(dòng)，使宿主細(xì)胞膜內(nèi)陷，蟲(chóng)體擠過(guò)連接區(qū)，進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部。入侵后蟲(chóng)體釋放ROPs和GRAs，此兩種蛋白通過(guò)聯(lián)合作用形成PV將蟲(chóng)體包裹以防止被宿主細(xì)胞清除。寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)的蟲(chóng)體通過(guò)從宿主細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在PV內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂并繁殖，最終破出宿主細(xì)胞，形成的新速殖子則又開(kāi)始新一輪的入侵。

3　弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白的特點(diǎn)及其研究現(xiàn)狀

GRAs的免疫原性較高，同時(shí)也是構(gòu)成弓形蟲(chóng)緩殖子囊壁和弓形蟲(chóng)速殖子PVM的重要組分，現(xiàn)已報(bào)道的GRAs有21種，其中包括2個(gè)三磷酸核苷酸水解酶和2個(gè)蛋白酶抑制劑。目前GRA1、GRA2、GRA3、GRA4、GRA6、GRA7及GRA15研究較多[6]，現(xiàn)將常見(jiàn)的致密顆粒蛋白的研究現(xiàn)狀總結(jié)歸納如下。

3.1GRA1

GRA1又稱(chēng)P24，為斷裂基因，基因序列全長(zhǎng)573 bp，內(nèi)含子約135 bp[7]，蛋白約為24 ku，有2個(gè)鈣離子結(jié)構(gòu)域，主要參與修飾并調(diào)理PV結(jié)構(gòu)，1989年Delauw等[8]首次完成了GRA1的構(gòu)建并報(bào)道了GRA1基因的生物學(xué)特性。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞后，GRA1被分泌入PV管腔作為靜脈與膜質(zhì)管狀網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)的可溶性蛋白，具有激活以及穩(wěn)定PV網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的功能。GRA1具有較強(qiáng)的免疫原性，在各期均可表達(dá)，可作為致密顆粒蛋白的標(biāo)記基因。謝榮華[9]通過(guò)GRA1蛋白與匹多莫德的聯(lián)合使用，成功刺激機(jī)體使宿主細(xì)胞產(chǎn)生了較高的細(xì)胞與體液免疫。孫玲[10]利用GRA1/MIC6基因?qū)Ω腥竟蜗x(chóng)的小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明用重組蛋白免疫小鼠，小鼠血清IFN-γ和IL-2細(xì)胞因子水平與對(duì)照組存在顯著的差異，且用重組蛋白免疫組的小鼠存活率也得到了提高。

3.2GRA2

GRA2又稱(chēng)P28，基因序列全長(zhǎng)1.3 kb，內(nèi)含子約241 bp，蛋白約28.5 ku。成熟的mRNA長(zhǎng)約1.1 kb，可翻譯的產(chǎn)物多肽由185個(gè)氨基酸組成(含3個(gè)α螺旋的兩性區(qū)域)，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。GRA2可與GRA4、GRA6在PVM上結(jié)合并形成多聚復(fù)合體，參與PV內(nèi)蛋白質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。Mercier等通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞后GRA2對(duì)誘導(dǎo)PV表面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成意義重大。GRA2在速殖子期和緩殖子期均可存在，是潛在的抗原標(biāo)記物。GRA2可誘發(fā)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)[11]，屬弓形蟲(chóng)毒力相關(guān)的基因。有研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小鼠被GRA2敲除突變體感染后，其宿存活率大大提高。黃敏君等[12]構(gòu)建了弓形蟲(chóng)GRA2全基因組蛋白質(zhì)粒，為研究宿主細(xì)胞與GRA2的相互作用起到了重要作用。

3.3GRA3和GRA5

GRA3為單拷貝基因，無(wú)內(nèi)含子，蛋白約30 ku，編碼220個(gè)氨基酸,其主要存在于弓形蟲(chóng)速殖子期，在體內(nèi)具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。GRA3基因的首次克隆研究始于1994年[13],GRA3一直被認(rèn)為缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，其N(xiāo)端分泌的信號(hào)序列與其跨膜區(qū)相符也使得GRA3以低聚物形式的可溶性蛋白質(zhì)嵌入PV的脂質(zhì)雙分子層，對(duì)于PVM的形成具有重要的作用。GRA5與GRA3相似，都在PVM中被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)即是可溶性蛋白又是疏水性的聚合物。GRA5又稱(chēng)P21，無(wú)內(nèi)含子，基因全長(zhǎng)834 bp，編碼21 ku的蛋白[14]。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞期間GRA5以可溶性形式被分泌入PV，隨后跨膜插入到PVM，同時(shí)其N(xiāo)-端投射到宿主細(xì)胞質(zhì)中，而C-末端則保留在液泡腔中。GRA5存在于寄生蟲(chóng)的所有生命階段，不僅在侵入宿主細(xì)胞中扮演重要作用，同時(shí)也參與了PV的維護(hù)。

3.4GRA4

GRA4為單拷貝基因，不含內(nèi)含子，基因全長(zhǎng)1 536 bp，內(nèi)含1 038 bp的開(kāi)放閱讀框，并且編碼346個(gè)氨基酸，1991年Johnson等對(duì)弓形蟲(chóng)GRA4首次進(jìn)行克隆并測(cè)序。GRA4與GRA1和GRA2一樣存在于PV內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，其N(xiāo)-端具有疏水性[15]。GRA4有較強(qiáng)的抗原性，據(jù)報(bào)道用純化后的GRA4免疫小鼠，小鼠存活率可達(dá)75%。GRA4普遍存在于被急性和慢性弓形蟲(chóng)感染的血清中，有報(bào)道稱(chēng)GRA4存在1個(gè)T細(xì)胞表位和3個(gè)以上的B細(xì)胞表位可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多種抗體且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫。高洋[16]通過(guò)試驗(yàn)成功構(gòu)建了重組貓皰疹病毒穿梭質(zhì)粒pBS-TK-SAG1/GRA4，并獲得了良好的反應(yīng)原性。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)GRA4能夠首先誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-γ，其次產(chǎn)生IL-4、IL-10等細(xì)胞因子[17]。

3.5GRA6

GRA6以單拷貝形式存在，無(wú)內(nèi)含子，基因序列全長(zhǎng)1 632 bp，有一個(gè)735 bp的開(kāi)放閱讀框，蛋白分子質(zhì)量32 ku，編碼230個(gè)氨基酸[18]。其產(chǎn)物為1個(gè)偏向N端的和1個(gè)位于中央位置并具有跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)域。當(dāng)宿主細(xì)胞被弓形蟲(chóng)速殖子入侵后，GRA6移動(dòng)到PV的后部來(lái)穩(wěn)定PV的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Lecordier等通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRA6 N端多肽含有一種抗原表位可被B淋巴細(xì)胞識(shí)別，而Sun等則通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)GRA6可使宿主體內(nèi)的T細(xì)胞增殖。彭武麗等[4]以GRA6為目的基因成功建立了一套快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)弓形蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。李瑾等[19]則通過(guò)對(duì)弓形蟲(chóng)GRA6基因的重組表達(dá)等研究，為弓形蟲(chóng)病診斷抗原試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3.6GRA7

GRA7又稱(chēng)P29，基因序列全長(zhǎng)1.3 kb，其分子質(zhì)量約29 ku，編碼236個(gè)氨基酸，有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。Fisher等和Jacobs等于1998年分別報(bào)道了不同蟲(chóng)株的GRA7，并表示GRA7分布于包囊壁中以及弓形蟲(chóng)多個(gè)生活史階段[20]，目前發(fā)現(xiàn)該蛋白是唯一一個(gè)可以通過(guò)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)膜連接蟲(chóng)體和宿主細(xì)胞的膜內(nèi)蛋白。以往研究發(fā)現(xiàn)GRA7與弓形蟲(chóng)毒力相關(guān)并且表達(dá)水平很高，有較高的抗原性[21]，可誘導(dǎo)機(jī)體主動(dòng)產(chǎn)生黏膜免疫和全身性免疫，且可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體應(yīng)答。通過(guò)免疫熒光顯色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)速殖子中GRA7分布于PV中，而存在于緩殖子的GRA7則分布在宿主細(xì)胞的胞漿中。洪彩玲[22]通過(guò)驗(yàn)證GRA7與宿主組分的相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GRA7具有較好的抗原性是一種潛在的診斷弓形蟲(chóng)感染有效的抗原分子，同時(shí)也與PV的形成相關(guān)。Alaganan A等[23]則發(fā)現(xiàn)GRA7效應(yīng)物與小鼠的急性毒力相關(guān)，可以增強(qiáng)免疫相關(guān)GTPase的回收利用。

3.7GRA8

GRA8基因全長(zhǎng)1 311 bp，含有241 bp的內(nèi)含子和804 bp的開(kāi)放閱讀框，其分子質(zhì)量為38 ku，編碼267個(gè)氨基酸，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與GRA8同源的蛋白。GRA8基因是通過(guò)弓形蟲(chóng)單克隆抗體MabA3.2對(duì)弓形蟲(chóng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選等方面的研究發(fā)現(xiàn)的[24]。Babaie J等[25]還發(fā)現(xiàn)GRA8包含1個(gè)氨基酸末端信號(hào)肽，3個(gè)富含脯氨酸的中央?yún)^(qū)域及1個(gè)鄰近羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域。袁仁善等[26]構(gòu)建了GRA8的原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并分析了其不同片段在大腸埃希菌中的表達(dá)情況，最終發(fā)現(xiàn)純化后的截短型GRA8具有一定的抗原反應(yīng)性，這一研究為弓形蟲(chóng)病的診斷奠定了基礎(chǔ)。

3.8GRA9、GRA10和GRA12

GRA9有2個(gè)內(nèi)含子，其分子質(zhì)量大約41 ku，編碼318個(gè)氨基酸，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，通過(guò)熒光顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其存在于PVM上。GRA9存在可溶和非可溶兩種狀態(tài)，其主要的生物學(xué)功能為維持PV的空間穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)PV網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。GRA10分子質(zhì)量約36 ku，編碼364個(gè)氨基酸，其氨基酸序列含有一個(gè)N末端信號(hào)序列，以及2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞rRNA的合成。GRA10為可溶性的GRAs可以被分泌到PV中以及弓形蟲(chóng)胞質(zhì)中[27]。在寄生蟲(chóng)入侵開(kāi)始后不久,GRA12從蟲(chóng)體前段分泌到PV，然后通過(guò)一系列遷移，最后駐留在整個(gè)液泡空間，與成熟的膜質(zhì)納米管網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，GRA12同GRA2及GRA6功能相似[28]。

3.9GRA14

GRA14無(wú)內(nèi)含子，基因全長(zhǎng)1 227 bp，Rome M E等[29]于2008年報(bào)道了GRA14，該蛋白的跨膜方式與GRA5相反即C端位于弓形蟲(chóng)的細(xì)胞膜之外而N端則在PVM內(nèi)部。陳銳釗等[30]通過(guò)對(duì)不同宿主和不同地理來(lái)源的9株弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株GRA14基因的克隆及一系列分析，推導(dǎo)出致密顆粒蛋白GRA14的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要通過(guò)3個(gè)β折疊、6個(gè)α螺旋、11個(gè)β轉(zhuǎn)角及多個(gè)無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成。有研究顯示GRA14存在于PVM中，有較好的保守性，可作為新型的弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原分子。

3.10GRA15

GRA15主要在速殖子期表達(dá)，是一種擁有獨(dú)特功能的多態(tài)性分泌蛋白，它不包含任何保守結(jié)構(gòu)域，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與GRA15有同源性的蛋白質(zhì)。有研究證明GRA15可以很好的誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的CTL效應(yīng)[31]。研究還發(fā)現(xiàn)GRA15可活化NF-κB信號(hào)通路，最終達(dá)到干擾小鼠GBP和PVM的相互結(jié)合[32]。

4　結(jié)語(yǔ)

弓形蟲(chóng)感染可以引起多種病癥，不但威脅人類(lèi)健康，還嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外科研工作者雖然對(duì)弓形蟲(chóng)做了詳細(xì)研究并取得了一些成績(jī)，但卻因?yàn)楣蜗x(chóng)宿主范圍廣，生活史復(fù)雜，抗原成分復(fù)雜，致病蛋白種類(lèi)多樣，至今仍存在許多亟待解決的問(wèn)題。GRAs作為蟲(chóng)體在宿主細(xì)胞內(nèi)存活的關(guān)鍵蛋白，以及PV的重要的代謝分泌抗原之一，對(duì)于弓形蟲(chóng)病診斷意義重大。因此，深入研究GRAs對(duì)弓形蟲(chóng)病的防治具有重要價(jià)值。相信隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多未知種類(lèi)及功能的弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，會(huì)為今后弓形蟲(chóng)病的診斷與治療提供重要幫助。參考文獻(xiàn)：

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Progress on Toxoplasma gondii Dense Granule Proteins

WANG Ying-he1,2，CAO Li-li2，YAO Xin-hua2，YUAN Shu-xian2，GUO Yan-bing2，GONG Peng-tao3，DING He3，DONG Hang3，WEI Feng1

(1.College of life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun,Jilin,130118,China;2.JilinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,Changchun,Jilin,130062,China;3.CollegeofAnimalScienceandVeterineryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China)

Toxoplasmagondiiis an intracellular parasitic protozoa,which caused zoonosis poses a threat to public health and safety.Toxoplasmagondiidense granule protein which is a kind of immune active protein secreted by theToxoplasmagondiidense granule cell is closely related to the parasitism and development of the parasite,so it is candidate antigen ofToxoplasmagondiivaccine.In this paper,the new discovery and progress of the research on the dense granular protein in recent years were reviewed to provide a reference for the in-depth research in the future.

Toxoplasmagondii;dense granule protein;immunoactive protein

2016-02-11

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAI07B02)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302076，31472183)；吉林省留學(xué)人員科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2012)；吉林省公益性科研單位基本科研專(zhuān)項(xiàng)社會(huì)公益研究項(xiàng)目(2060302)

王英賀(1991-)，女，吉林公主嶺人，碩士，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.72

A

1007-5038(2016)08-0075-04