樊翀宇，呂繼洲，楊曉野，吳紹強*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100029)

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兔艾美耳球蟲分子生物學(xué)鑒定技術(shù)研究進展

樊翀宇1,2，呂繼洲2，楊曉野1，吳紹強2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100029)

感染兔的艾美耳屬球蟲主要有11種，其對世界養(yǎng)兔業(yè)的危害日益嚴重。論文綜述了國內(nèi)外兔艾美耳球蟲分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的研究進展，基于不同靶標(biāo)序列分類總結(jié)和分析了鑒定技術(shù)的優(yōu)點和存在的問題，展望了未來兔艾美耳球蟲分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢，以期為兔艾美耳球蟲病的診斷、預(yù)防和控制提供技術(shù)手段和方法依據(jù)。

兔；艾美耳球蟲；分子生物學(xué)；鑒定技術(shù)

兔球蟲病是家兔中常見的一類寄生蟲病，對養(yǎng)兔業(yè)危害很大，是養(yǎng)兔生產(chǎn)中長期存在的一個難題。各品種家兔對艾美耳球蟲(Eimeria)都易感染，特別是斷奶到4月齡的小兔最易發(fā)病[1]。幼兔的球蟲感染率一般為90%，病死率為40%～70%[2]。耐過球蟲病未死亡的或經(jīng)治愈的家兔多成為長期帶蟲者，是該病的傳染源[3]。鑒于兔球蟲病危害的嚴重程度，我國農(nóng)業(yè)部將其列入《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的二類動物疫病。為防止該病跨境傳入傳出，2013年發(fā)布的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中也收錄了兔球蟲病。

兔球蟲病主要是由寄生在腸道和膽管上皮細胞的艾美耳屬球蟲引發(fā)[4]。世界上已報道的感染兔的艾美耳球蟲包括斯氏艾美耳球蟲(E.stiedai)、小型艾美耳球蟲(E.exigua)、中型艾美耳球蟲(E.media)、大型艾美耳球蟲(E.magna)、黃艾美耳球蟲(E.flavescens)、盲腸艾美耳球蟲(E.coecicola)、腸艾美耳球蟲(E.intestinalis)、無殘艾美耳球蟲(E.irresidua)、梨形艾美耳球蟲(E.piriformis)、維氏艾美耳球蟲(E.vejdovskyi)及穿孔艾美耳球蟲(E.perforans)[5-8]。

兔球蟲病傳統(tǒng)上以糞便檢查為主要確診手段，通過對糞便中卵囊的形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特性，主要是球蟲卵囊的大小、形態(tài)、內(nèi)部構(gòu)造及發(fā)育時間等特征進行鑒定，確定感染球蟲種類[9]。但是，依靠形態(tài)學(xué)鑒定球蟲種類容易出現(xiàn)如下問題：首先，全面掌握所有11種兔球蟲種類的形態(tài)學(xué)特征及區(qū)分方法需要耗費大量的時間，而且十分困難；其次，不同種類兔球蟲卵囊之間的形態(tài)、大小極為相近，即使經(jīng)驗豐富的專家也難以將它們區(qū)分。除此之外，兔球蟲感染往往是腸道兔球蟲和肝臟兔球蟲同時感染，單一個體內(nèi)存在2種或2種以上兔球蟲的情況比較普遍[10]?；谏鲜鲈?，研發(fā)兔球蟲病病原種類的特異性診斷技術(shù)及簡便易行的分子生物學(xué)種類鑒定方法勢在必行。

本文就近年發(fā)展起來的有關(guān)感染兔的艾美耳球蟲的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)和方法進行了綜述與探討，以便為兔球蟲病的分子生物學(xué)診斷體系的建立與應(yīng)用提供參考。

1　兔艾美耳球蟲分子生物學(xué)鑒定方法

1.1基于核基因組的鑒定技術(shù)

1.1.1普通PCR方法2010年，崔平等分別成功分離了腸艾美耳球蟲[1]、黃艾美耳球蟲[11]和大型艾美耳球蟲[12]卵囊并提取基因組，根據(jù)GenBank中各自的18 S rDNA序列設(shè)計引物，建立了針對這3種艾美耳球蟲的PCR鑒定方法，均擴增出了清晰條帶，經(jīng)比對，目的產(chǎn)物與GenBank中序列同源性在98.5%以上。2014年，石團員等[13]以中國家兔的腸艾美耳球蟲為對象，根據(jù)18 S rRNA基因序列進行PCR擴增，經(jīng)測序和比對，結(jié)果表明國內(nèi)艾美耳球蟲的18 S rRNA基因序列與法國和捷克分離的同種艾美耳球蟲同源性分別為100%和96%。

2011年方素芳等[14-15]根據(jù)GenBank中發(fā)表的艾美耳屬球蟲18 S rDNA和5.8 S rDNA序列設(shè)計引物，通過PCR擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS-1)，分別以腸艾美耳球蟲卵囊基因組和黃艾美耳球蟲卵囊基因組為模板，擴增出了預(yù)期片段。2012年 ，顧小龍等[16]先是利用艾美耳屬球蟲18 S rDNA和5.8 S rDNA保守引物，PCR擴增3種兔球蟲(大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲)ITS-1片段，隨后又對國內(nèi)5種兔球蟲(大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲及穿孔艾美耳球蟲)ITS-1序列進行擴增分析，與GenBank中序列同源性均在96.9%以上，表明ITS-1序列可作為兔球蟲分子鑒定的遺傳標(biāo)記[17]。但由于ITS-1長度有限，不適合多重PCR等一些對遺傳標(biāo)記有長度要求的鑒別方法。鑒于此，許家園等[10]在2014年對3種常見兔艾美耳球蟲的ITS全序列進行了PCR擴增和序列測定，并與GenBank中的相應(yīng)序列比對，試驗結(jié)果與Kvicerova等用18 S rDNA進行系統(tǒng)進化分析的結(jié)果一致，表明ITS序列可應(yīng)用于兔球蟲的系統(tǒng)進化研究，為兔球蟲的分類鑒定、分子流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

2013年，閆文朝等[18]擴增了6種兔艾美耳球蟲的ITS1-5.8S-ITS2完整序列。結(jié)果顯示，每一種兔球蟲的ITS1和ITS2序列都具有特異性。基于ITS1和ITS2的多態(tài)位點，他們建立了一種特異、敏感的多重PCR診斷方法，用于區(qū)分和鑒定斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲這3種高致病性艾美耳球蟲。此項研究為兔高致病性艾美耳球蟲的臨床鑒別和兔球蟲病的群體遺傳學(xué)研究提供了依據(jù)。

1.1.2套式PCR方法2011年，Oliveira U C等[19]根據(jù)11種兔艾美耳球蟲各自的ITS1區(qū)序列設(shè)計特異性引物，建立了針對不同種球蟲的套式PCR方法。經(jīng)特異性試驗驗證，種間無交叉反應(yīng)；敏感性試驗結(jié)果顯示，檢測限從500 fg到1 pg不等，相當(dāng)于0.8個～1.7個孢子化卵囊，且用3種不同品牌的擴增酶得到了一致的敏感性結(jié)果。這些敏感性好、特異性高的方法為兔艾美耳球蟲流行病學(xué)調(diào)查提供了有效途徑。

2014年，王云周等[20]對斯氏艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲的單卵囊基因組DNA進行隨機擴增，然后用WGA(whole genome amplification)的產(chǎn)物作為模板，根據(jù)2種艾美耳球蟲的ITS-1、18 S rDNA和23S rDNA設(shè)計特異性引物，建立了套式PCR方法。此方法可成功擴增出單卵囊基因，用這些單卵囊分離斯氏艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲的方法所進行的種類鑒定，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全一致，這表明套式PCR方法在艾美耳球蟲單卵囊水平的分子生物學(xué)鑒定中具有實用性，該方法也可應(yīng)用到其他寄生蟲的鑒定。

1.1.3實時熒光定量PCR方法2015年，許家園等[21]針對腸艾美耳球蟲ITS2序列設(shè)計1對特異性引物，以10倍倍比稀釋的已知卵囊含量的腸艾美耳球蟲DNA為模板進行SYBR Green Ⅰ real-time PCR的擴增和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。結(jié)果顯示，最低可檢測1個卵囊含量的樣品，與同屬的大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲均不發(fā)生交叉反應(yīng)。表明建立的實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好，為快速檢測腸艾美耳球蟲提供了有效的方法。

1.2基于線粒體基因組(mtDNA)的鑒定技術(shù)

2012年，田思勤等[22]根據(jù)艾美耳球蟲線粒體cytb基因設(shè)計保守引物，擴增兔6種艾美耳球蟲cytb基因部分序列。根據(jù)獲得cytb基因已知序列，設(shè)計長PCR引物，建立了套式PCR方法，獲得了6種兔球蟲mtDNA全序列。然后分析了6種艾美耳球蟲線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)、核苷酸組成、密碼子使用情況等信息，以線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因為標(biāo)記，構(gòu)建進化樹，探討兔艾美耳球蟲在頂復(fù)門寄生蟲中的進化位置。

2015年，劉國華等[23]針對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲5種常感染家兔的艾美耳球蟲的線粒體基因設(shè)計長PCR引物，建立了普通PCR鑒定方法并獲得了這5種球蟲線粒體基因組序列。通過對mtDNA的標(biāo)記來進行群體遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)的研究，為分子診斷、預(yù)防和控制兔球蟲做出貢獻。

1.3基于頂質(zhì)體基因組的鑒定技術(shù)

田思勤等[24]2014年采用劉國昌[25]報道的堆型艾美耳球蟲rpoB和TufA基因的擴增引物，建立了針對兔艾美耳球蟲rpoB和TufA基因的PCR技術(shù)，并利用生物學(xué)軟件與GenBank中收錄的頂復(fù)門寄生蟲相關(guān)序列進行比對和進化分析。結(jié)果表明，擴增的兩種兔艾美耳球蟲rpoB和TufA基因片段的大小均相同，兩種球蟲rpoB和TufA基因種間的差異分別為6.8%和0.2%，rpoB基因差異相對較大，而TufA基因差異較小。因此，rpoB基因序列可以作為兔艾美耳球蟲種間的遺傳標(biāo)記，用得到的rpoB基因序列為參考與其他頂復(fù)門寄生蟲進行進化分析進一步證明了該結(jié)論，首次報道兔艾美耳球蟲頂質(zhì)體rpoB和TufA基因的部分序列，為兔艾美耳球蟲的鑒定和進化分析提供參考依據(jù)，也為頂復(fù)門頂質(zhì)體的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

2　不同分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的評價

國內(nèi)外用于鑒定兔球蟲的分子生物學(xué)方法和技術(shù)有很多，不同技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點。崔平等人先后用普通PCR方法擴增ITS1序列，對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和穿孔艾美耳球蟲進行同源鑒定，同源性在96.9%以上。其中建立的針對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲PCR方法的敏感性結(jié)果顯示最低能檢出27個孢子化卵囊。此種方法成本低，操作簡便，但是擴增產(chǎn)物需要純化測序，浪費時間，且易出現(xiàn)假陰性。套式PCR由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大的可能性，保證了反應(yīng)的特異性，也極大的提高了PCR的敏感性，可以檢出單個卵囊；但是套式PCR方法仍需要對結(jié)果進行電泳測定，費時費力，假陽性率高。實時熒光定量PCR通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使PCR擴增和終產(chǎn)物檢測全處在封閉的條件下進行，從而具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應(yīng)模板進行準(zhǔn)確定量，極大的克服了普通PCR和套式PCR技術(shù)的不足。許家園建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法能夠定量檢測到含有一個卵囊含量的樣本，敏感性和特異性都較高[21]。然而，SYBR Green染料的特異性還有待提高。

無論哪一種兔球蟲的分子鑒定技術(shù)，其中DNA擴增引物的設(shè)計是關(guān)鍵，引物的特異性直接影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前文獻報道最多的引物主要有兩類，一類是根據(jù)球蟲的保守序列設(shè)計的引物，最常選用的靶基因是核糖體基因，其中包括18 S、5.8 S、28 S rDNA。在18 S rDNA與5.8 S rDNA 之間以及5.8 S rDNA與28 S rDNA之間有內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)。ITS序列具有功能上的保守性和進化上的時鐘性[26]，被越來越多地用于物種分類和遺傳進化關(guān)系的研究[27-28]；另一類是基于線粒體基因組的鑒定技術(shù)，mtDNA結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定、以母系方式遺傳，不受父本的影響；核苷酸歧異度大、進化速度快等特點，使得mtDNA在種間、種內(nèi)、群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性，常被作為可靠的遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于相近寄生蟲種類鑒定[29-30]。COI基因?qū)倬€粒體基因，其編碼的COI為呼吸鏈的重要組分，普通存在于原核生物和真核生物細胞的線粒體中，其進化速度比核基因快10倍以上，故易受環(huán)境的影響及誘導(dǎo)而體現(xiàn)進化過程。

3　展望

分子生物學(xué)鑒定技術(shù)在檢測和鑒定兔球蟲種類方面的研究發(fā)展迅速，不斷有新的技術(shù)方法出現(xiàn)，顯示出較好的應(yīng)用前景，分子生物學(xué)鑒定方法已部分取代了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，應(yīng)用于鑒定工作中。如TaqMan探針法實時熒光定量PCR，因其重復(fù)性好、特異性強、線性范圍寬等特點在各個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)的引入進一步提升了該方法的靈敏度，增加了其可靠性和實用性[31]。焦磷酸測序技術(shù)是一種新的DNA序列分析技術(shù)，其特點是操作簡便、大通量、自動化，適合大量樣本的快速檢測，無須進行電泳、DNA序列無須熒光標(biāo)記等，是一個理想的遺傳分析技術(shù)平臺。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)是一種新的恒溫核酸擴增技術(shù)，具有特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點。該技術(shù)已被用于多種病原微生物的檢測。相對于一般意義上的生物芯片，液相芯片具有高通量、高靈敏度、檢測準(zhǔn)確、重復(fù)性好、線性范圍寬廣等優(yōu)勢，液相芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。目前，應(yīng)用這些技術(shù)對艾美耳球蟲進行檢測的方法還未見報道。相信未來實時熒光定量PCR、LAMP、液相芯片等方法的應(yīng)用將克服現(xiàn)有兔艾美耳球蟲檢測方法存在的各種問題，為兔球蟲物種鑒定、檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供更好的技術(shù)，滿足口岸科學(xué)檢疫把關(guān)的技術(shù)需求。

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Progress on Molecular Identification Techniques of Rabbit Eimeria spp.

FAN Chong-yu1,2,Lü Ji-zhou2,YANG Xiao-ye1,WU Shao-qiang2

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia，010018,China;2.InstituteofAnimalQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing,100029,China)

At present,11Eimeriaspecies that could infect rabbits were recognized.Coccidiosis could cause significant economic losses to rabbit industry worldwide.This paper reviewed the research progress on the molecular techniques adopted in rabbitEimeriaspecies identification,and discussed the advantages and the problems of these molecular methods.Besides,this paper also made a forecast on the tendency of molecular techniques in rabbitEimeriaspecies identification,which would be helpful in the diagnosis,prevention and control of rabbit coccidiosis.

rabbit;Eimeriaspp; molecular identification; technique

2016-03-08

國家科技支撐計劃項目(2012BAK11B04)

樊翀宇(1990-)，女，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，獸醫(yī)碩士，主要從事動物寄生蟲學(xué)研究。*通訊作者

S852.723

A

1007-5038(2016)08-0087-04