董　浩,彭小薇,趙柏林,孫　雨,曲　萍,王曉英,胡冬梅,石　慧,宋曉暉*

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 102600；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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布魯菌sRNA研究進(jìn)展

董浩1,彭小薇2,趙柏林1,孫雨1,曲萍1,王曉英1,胡冬梅1,石慧1,宋曉暉1*

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 102600；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯菌病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的公共衛(wèi)生安全。作為布魯菌病的病原，布魯菌能夠耐受宿主體內(nèi)的各種殺菌機(jī)制并持續(xù)的生存。細(xì)菌的sRNA在基因組中被轉(zhuǎn)錄，但絕大多數(shù)sRNA并不編碼蛋白質(zhì)。sRNA通過堿基配對(duì)與mRNA結(jié)合，影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯，從而調(diào)控細(xì)菌代謝、群體感應(yīng)、環(huán)境應(yīng)激及細(xì)菌毒力基因表達(dá)等生物過程。通過sRNA調(diào)控毒力相關(guān)基因表達(dá)，使布魯菌可以耐受多種胞內(nèi)應(yīng)激環(huán)境。目前為止，僅有少數(shù)布魯菌sRNA的功能得到了較全面的研究，論文對(duì)這些sRNA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

布魯菌；sRNA；基因表達(dá)；毒力基因

布魯菌作為一種兼性的胞內(nèi)寄生菌，可以在專業(yè)和非專業(yè)的吞噬細(xì)胞內(nèi)生存。當(dāng)布魯菌侵入宿主細(xì)胞后，面臨著惡劣的生存環(huán)境(酸性、強(qiáng)氧化性、高滲透壓和營(yíng)養(yǎng)缺乏等)[1]。為了適應(yīng)這些外部的應(yīng)激環(huán)境，布魯菌必須在轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后、翻譯等不同層次上對(duì)自身基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。目前，在布魯菌中轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控已經(jīng)進(jìn)行了非常廣泛的研究，然而轉(zhuǎn)錄后(比如sRNA)及翻譯水平的研究至今仍不多見。

生物體中存在大量的非編碼RNA(non-coding RNA，也叫small RNA，sRNA)，隱藏在基因組內(nèi)，有學(xué)者稱之為基因組內(nèi)的“暗物質(zhì)”，不可見卻發(fā)揮著調(diào)控基因表達(dá)的重要功能。sRNA在細(xì)菌、古生菌和真核生物體中廣泛的存在。起初，sRNA的研究主要集中于真核生物，后來才漸漸把注意力轉(zhuǎn)移到原核生物，尤其是病原細(xì)菌[2-3]。

1　細(xì)菌sRNA的簡(jiǎn)介

1.1細(xì)菌sRNA發(fā)現(xiàn)的歷史

由于非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄后通常并不翻譯為蛋白質(zhì)，許多年來一直被認(rèn)為其不具備生物學(xué)功能。直到1967年，通過標(biāo)記大腸埃希菌體內(nèi)所有的RNA，在聚丙烯酰胺凝膠上探測(cè)到由大腸埃希菌基因ssrS所編碼的一種新的數(shù)量較多的RNA分子，從而發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的首個(gè)非編碼RNA-6SRNA[4]。1984年，在大腸埃希菌中鑒定了第1個(gè)染色體編碼的sRNA，MicF(174核苷酸)，其可以抑制OmpF mRNA的轉(zhuǎn)錄[5]。2000年，通過傳統(tǒng)方法(例如聚丙烯酰胺凝膠電泳分離)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13個(gè)sRNA。其中，RprA、MicF、DicF及DsrA是作為基因片段被發(fā)現(xiàn)的；GcvB和OxyS是在探查基因時(shí)偶然被發(fā)現(xiàn)的；而Spot42、10Sa(tmRNA)和10Sb等則是通過磷酸化標(biāo)記所有的RNA后發(fā)現(xiàn)的,但是它們的生理功能直到30年后才被闡明[6]。2001年， 由于應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析基因組基因間區(qū)域及研發(fā)了一些新的檢測(cè)技術(shù)，如比較基因組學(xué)、基因芯片、RNA組學(xué)和深度測(cè)序，在全基因組水平上驗(yàn)證出了許多細(xì)菌的新的sRNA，包括大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、 綠膿假單胞菌、金黃色釀膿葡萄球菌和單核細(xì)胞增多性李斯特菌[7]。2011年，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)反式編碼的sRNA-tracrRNA，其通過24個(gè)核苷酸序列與CRISPR RNAs(crRNA)前體轉(zhuǎn)錄單元的重復(fù)序列配對(duì)從而促進(jìn)crRNA的成熟，首次揭示了sRNA參與細(xì)菌RNA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[8]。時(shí)至今日，鑒定出的大腸埃希菌的sRNA已經(jīng)超過80個(gè)。而從sRNA的數(shù)據(jù)庫sRNAMap可以得知，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)900多個(gè)sRNA，它們大多數(shù)位于基因間隔區(qū)中[9]。

1.2sRNA的主要特征

細(xì)菌的sRNA具有以下特征：①其長(zhǎng)度一般介于40 nt～500 nt之間，長(zhǎng)于真核生物中成熟的miRNA；②其大部分位于間隔區(qū)(IGR)中，少部分位于3′UTR或5′UTR(例如RyeB和SraC/RyeA)；③通過多種試驗(yàn)方法和生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，sRNA除了分布在核心基因組中，有些sRNA甚至位于插入序列、質(zhì)粒、噬菌體和致病島上；④1個(gè)sRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)靶mRNA，一個(gè)靶mRNA也可能受多個(gè)sRNA調(diào)節(jié)；⑤大多數(shù)sRNA是通過與RNA結(jié)合蛋白以復(fù)合物形式發(fā)揮作用[10]。

1.3sRNA的分類

1.3.1根據(jù)位置分類基于在基因組上的位置，sRNA可以分為順式編碼sRNA(cis-acting sRNA)及反式編碼sRNA(trans-encoded sRNA)。順式編碼sRNA位于靶mRNA的DNA互補(bǔ)鏈上，通過直接與靶序列的互補(bǔ)配對(duì)發(fā)揮作用；而反式編碼sRNA與配對(duì)靶mRNA有一定的距離，通常只存在唯一互補(bǔ)的靶點(diǎn)[11]。

大多數(shù)順式編碼的反義RNA位于質(zhì)粒、噬菌體和轉(zhuǎn)座子中，也在細(xì)菌染色體中發(fā)現(xiàn)了一部分順式編碼的RNA[12]。在細(xì)菌里，順式編碼是sRNA與它們互作的靶mRNA進(jìn)行堿基反向配對(duì)，通常導(dǎo)致了對(duì)靶mRNA的負(fù)調(diào)控作用，包括復(fù)制起始、接合效率、自殺、轉(zhuǎn)座、mRNA降解及翻譯起始[13]。

反式編碼的sRNA則位于細(xì)菌染色體上，對(duì)它們的靶mRNA則有可能起正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的作用。大部分反式編碼的sRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，有些甚至類似全局調(diào)控子對(duì)許多細(xì)胞生理活動(dòng)做出反應(yīng)[14]。

1.3.2根據(jù)生物學(xué)及作用機(jī)制分類根據(jù)sRNA的生物學(xué)及作用機(jī)制，可以將其分為三類。

(1) 具有特殊活性的sRNA 行使管家功能的sRNA，它們的表達(dá)水平通常是很高的。目前發(fā)現(xiàn)這一類型的sRNA有3種，包括轉(zhuǎn)移信使RNA(transfer messenger RNA或10 S sRNA)、具有酶催化活性且形成RNase P的催化亞單位MIRNA及組成核糖核蛋白(ribonueleoprotein，RNP)復(fù)合物4.5 S RNA。

(2) 與蛋白質(zhì)相互作用從而影響蛋白質(zhì)功能的sRNA 這類sRNA主要通過與蛋白質(zhì)互作從而影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，比如大腸埃希菌中第1個(gè)鑒定出來的6 S RNA，可以直接與σ70 RNA聚合酶互作并改變RNA聚合酶的活性，從而抑制啟動(dòng)子區(qū)域10 bp上游含TGn序列(TGnTATAAT)基因的轉(zhuǎn)錄。又如sRNA CsrB和CsrC可以與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子CsrA蛋白互作形成調(diào)控反應(yīng)回路。在此回路中，這兩個(gè)sRNA作為CsrA蛋白的拮抗物，可通過與CsrA結(jié)合嚴(yán)格調(diào)控CsrA蛋白的活性。

(3) 與目的mRNA配對(duì)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)的sRNA這種調(diào)控模式是細(xì)菌sRNA發(fā)揮調(diào)控功能最普遍的形式之一。目前，發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA大部分都屬于這種類型。sRNAs同靶mRNA結(jié)合后，要么促進(jìn)或抑制靶點(diǎn)mRNA的翻譯，例如sRNA分子Spot42和OxyS可以封閉靶mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)從而抑制靶基因的表達(dá)，DsrA和RprA同靶mRNA配對(duì)結(jié)合后能夠暴露其核糖體結(jié)合位點(diǎn)從而促進(jìn)目的基因翻譯；要么減緩或加速靶mRNA的降解，例如RyhB主要作為轉(zhuǎn)錄后抑制子影響靶基因sodB、sdhC、fumA mRNA的穩(wěn)定性從而調(diào)節(jié)鐵代謝[15]。

2　布魯菌sRNA研究進(jìn)展

有關(guān)布魯菌sRNA的研究起步較晚，2010年王同坤等[16]通過生物信息學(xué)方法對(duì)羊種布魯菌16M的sRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出22個(gè)假定編碼sRNA的序列，并從中鑒定出1個(gè)sRNA BSR-2。通過熒光定量PCR檢測(cè)該sRNA在△VirB缺失株和△vjbR缺失株中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在上述2種缺失株中BSR-2的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，由于VirB和VjbR是布魯菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)和布魯菌密度感應(yīng)系統(tǒng)中2個(gè)重要的毒力因子，提示其可能與布魯菌胞內(nèi)生存相關(guān)。

Caswell C C等[17]在2012年通過比較牛種布魯菌2308 hfq缺失株和野生株的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與土壤農(nóng)桿菌同源的sRNA AbcR1和AbcR2。這2個(gè)sRNA存在功能上的冗余，在牛種布魯菌2308中單獨(dú)缺失任意1個(gè)sRNA不能影響細(xì)菌毒力，只有同時(shí)缺失2個(gè)sRNA才會(huì)引起細(xì)菌在巨噬細(xì)胞及小鼠體內(nèi)毒力下降。進(jìn)一步研究表明，AbcR sRNA可能通過加速靶mRNA的降解影響了氨基酸和聚胺的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程從而影響細(xì)菌的致病性。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，根據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA的特征，出現(xiàn)了多種預(yù)測(cè)sRNA的生物信息學(xué)方法。2014年，作者所在的研究團(tuán)隊(duì)綜合了SIPHT和NAPP 2個(gè)預(yù)測(cè)sRNA的生物信息學(xué)方法，在牛種布魯菌2308株中預(yù)測(cè)出129個(gè)假定的sRNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)其中20個(gè)假定的sRNA進(jìn)行驗(yàn)證，成功鑒定出7個(gè)sRNA。在進(jìn)一步的研究中，采用Starpicker軟件對(duì)經(jīng)過驗(yàn)證的7個(gè)sRNA靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并通過大腸埃希菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Starpicker軟件對(duì)7個(gè)sRNA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)有4個(gè)是正確的[18]，這表明通過這種生物信息學(xué)方法對(duì)細(xì)菌sRNA的預(yù)測(cè)是確實(shí)可行的，并具有較高的準(zhǔn)確性。除此之外，Peng X等[19]對(duì)上述預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)順式表達(dá)的sRNA-BsrH，該sRNA直接調(diào)控著布魯菌鐵代謝相關(guān)基因hemH的表達(dá)，并且與布魯菌耐受缺鐵環(huán)境密切相關(guān)。

最近，Wang Y等[20]結(jié)合生物信息學(xué)和試驗(yàn)方法在羊種布魯菌16M中驗(yàn)證了8個(gè)新的sRNA，并發(fā)現(xiàn)其中的1個(gè)sRNA BSR0602在穩(wěn)定期、應(yīng)激環(huán)境、感染巨噬細(xì)胞及小鼠時(shí)表達(dá)顯著上升，過表達(dá)BSR0602的菌株在細(xì)胞模型和小鼠模型中毒力降低，故認(rèn)為BSR0602可能與細(xì)菌適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境和毒力機(jī)制相關(guān)。這是繼上述研究之后再次發(fā)現(xiàn)的與細(xì)菌應(yīng)激及毒力相關(guān)的sRNA。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得在全基因組范圍內(nèi)鑒定細(xì)菌的sRNA成為可能。Saadeh B等[21]采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)布魯菌的sRNA進(jìn)行了研究，結(jié)果鑒定出了33個(gè)可以與Hfq蛋白相互結(jié)合的sRNA。通過Northern blot和反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示10個(gè)在穩(wěn)定期早期表達(dá)的sRNA得到了驗(yàn)證。

3　展望

在其他細(xì)菌中的研究已經(jīng)表明，sRNA通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的耐受能力，調(diào)控毒力相關(guān)基因的表達(dá)。與其他細(xì)菌相比，布魯菌sRNA的研究才剛剛起步。作者所在研究團(tuán)隊(duì)也在早期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)sRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了全面驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了超過40個(gè)sRNA并對(duì)其表達(dá)特性、調(diào)控功能、與布魯菌毒力的相關(guān)性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)某些sRNA的不正常表達(dá)會(huì)顯著影響布魯菌的毒力(文章未發(fā)表)。從當(dāng)前布魯菌sRNA的研究進(jìn)展看，越來越多的證據(jù)也表明sRNA與布魯菌的毒力密切相關(guān)，因此作者深信對(duì)布魯菌sRNA功能的研究對(duì)揭示其致病機(jī)制和攻克布魯菌病治療難題都具有重要意義。

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Progress on Brucella sRNA

DONG Hao1,PENG Xiao-wei2,ZHAO Bo-lin1,SUN Yu1,QU Ping1,WANG Xiao-ying1,HU Dong-mei1,SHI Hui1,SONG Xiao-hui1

(1.China Animal Disease Control Center,Beijing,102600,China; 2.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing,100081,China)

Brucellosis is a serious zoonosis,which threatens the development of animal husbandry and human public health.As the pathogen of brucellosis,Brucellacan resist various bactericidal mechanisms and persist for a long time in the host cells.sRNAs can be transcripted from the bacterial genomes,while most of sRNAs do not encode proteins.Bacterial sRNAs affect stability or translation of mRNAs by base-pairing with their targets,resulting in regulating various biological processes,such as bacterial metabolism,quorum sensing,stress responses,and the expression of bacterial virulence genes.The sRNAs regulate the expressions of virulence related genes,which can make the pathogen resist to various intracellular stress environment.At present,only few number ofBrucellasRNAs have been studied comprehensively,and in this review we summarized the recent research progress onBrucellasRNAs.

Brucella; sRNA; gene expression; virulence gene

2016-01-31

董浩(1985-)，男，山東威海人，博士，主要從事人畜共患病防控技術(shù)相關(guān)研究。*通訊作者

S852.614

A

1007-5038(2016)08-0091-04