楊坤　解磊　朱偉民　黃江鴻　段莉　王大平

·綜述·

微RNA調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化的機(jī)制研究進(jìn)展

楊坤解磊朱偉民黃江鴻段莉王大平

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是軟骨組織工程的一種理想種子細(xì)胞，體外條件下誘導(dǎo)MSCs軟骨分化，將直接影響組織工程修復(fù)軟骨的成敗。微RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸左右的單鏈RNA，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控與軟骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路靶基因的表達(dá)，以此調(diào)控MSCs軟骨分化。本文就miRNA調(diào)控MSCs軟骨分化的機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。

微RNA；間充質(zhì)干細(xì)胞；軟骨分化；調(diào)控機(jī)制

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一類來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞，其來(lái)源十分廣泛，可以從骨髓、臍血、脂肪等組織中分離得到。MSCs具有自我增殖、更新的能力，并且可以被誘導(dǎo)向多種組織細(xì)胞分化，包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及脂肪細(xì)胞［1］。MSCs不僅易于體外大量擴(kuò)增，還是良好的外來(lái)基因?qū)胨拗?，在軟骨損傷疾病治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。MSCs軟骨分化主要經(jīng)歷間充質(zhì)細(xì)胞（前體軟骨細(xì)胞）、壓縮間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、增殖型軟骨細(xì)胞、前體肥大化軟骨細(xì)胞及肥大化軟骨細(xì)胞這6個(gè)階段［2］，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和相關(guān)信號(hào)通路共同相互調(diào)控完成。

微RNA（microRNA，miRNA）是由內(nèi)源基因編碼的短鏈非編碼RNA［3］，以多種形式存在于基因組的基因間隔區(qū)［4］，通過(guò)與靶mRNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū)特異性結(jié)合促進(jìn)靶mRNA的降解和（或）抑制蛋白翻譯，從而抑制靶基因的表達(dá)［5］，以此影響細(xì)胞的增殖、分裂、分化、代謝以及凋亡等生物過(guò)程。有研究報(bào)道，多種miRNA通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)調(diào)控軟骨分化過(guò)程［6］。

一、軟骨分化相關(guān)調(diào)控因子

Sox（Sry?related high mobility groupbox）是一類與Y染色體上性別決定基因Sry同源、具有特征性HMG?box序列的基因家族。由于Sox編碼的產(chǎn)物可以與DNA上的特異性序列結(jié)合，因此Sox家族被認(rèn)為在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Sox9作為一種轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞表型的“主調(diào)控因子”，在軟骨分化中發(fā)揮重要作用［7］。Sox9在壓縮間充質(zhì)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平較高，調(diào)控Ⅱ型膠原、Ⅺ型膠原及蛋白聚糖的表達(dá)，對(duì)軟骨形成發(fā)揮重要作用［8］，其同源家族中的轉(zhuǎn)錄因子Sox5和Sox6能提高Sox9的活性，對(duì)軟骨形成也是必需的［9］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor?β，TGF?β）是一類擁有眾多生物活性的多肽類生長(zhǎng)因子，人體內(nèi)存在4種亞型。TGF?β具有多重生物學(xué)效應(yīng)，是調(diào)節(jié)MSCs增殖并向軟骨細(xì)胞方向分化的最主要因子之一［10］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一類在骨和軟骨形成及穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用的生長(zhǎng)因子，至今發(fā)現(xiàn)的BMP有17種，絕大部分屬于TGF?β超家族成員。段曉輝等［11］研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞可通過(guò)分泌BMP來(lái)誘導(dǎo)骨與軟骨的形成。BMP與Ⅰ、Ⅱ型BMP受體結(jié)合而激活Smad及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路［12］。BMP?2和BMP?4是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化的重要生長(zhǎng)因子。

纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是一種具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、增殖與分化等多種生物活性的多聚肽。FGF通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體和（或）纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，激活包括MAPK及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在內(nèi)的多種信號(hào)通路，從而對(duì)軟骨細(xì)胞分化進(jìn)行調(diào)控［13］。

二、負(fù)向調(diào)控MSCs成軟骨分化的miRNA

轉(zhuǎn)錄因子Slug被認(rèn)為是MSCs成軟骨分化的一種負(fù)向調(diào)控因子［14］。Lolli等［15］對(duì)人臍帶血來(lái)源MSCs分別進(jìn)行了an?tagomiR?221轉(zhuǎn)染和siRNA沉默Slug的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低水平的Slug和miR?221可以增加Ⅱ型膠原、轉(zhuǎn)錄因子Sox9及TRPS1的表達(dá)，進(jìn)一步研究結(jié)果表明miR?221受到Slug的調(diào)節(jié)，這一研究提示可以通過(guò)下調(diào)MSCs軟骨分化負(fù)向調(diào)控的miR?NA，在轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化。Kim等［16］對(duì)雞的肢體MSCs成軟骨分化研究同樣表明miR?221負(fù)向調(diào)控MSCs成軟骨分化。然而，以上研究均并未發(fā)現(xiàn)miR?221的直接靶基因，也未能明確miR?221調(diào)控軟骨分化的具體機(jī)制。

Guérit等［17］的研究顯示在MSCs軟骨分化早期，miR?29a下調(diào)靶基因Foxo3A（一種轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)，抑制MSCs軟骨分化。Djouad等［18］卻發(fā)現(xiàn)上調(diào)Foxo3A在軟骨分化中起到抑制軟骨分化作用。Yan等［19］研究鼠MSCs軟骨細(xì)胞分化時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR?29a和miR?29b通過(guò)下調(diào)靶基因Col2a1表達(dá)，抑制MSCs軟骨分化。Foxo3A和Col2a1均為miR?29a的靶基因，一種miRNA可擁有多個(gè)靶基因，表明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

Lee等［20］研究證實(shí)miR?495在Sox9的3′?UTR存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，miR?495直接通過(guò)下調(diào)Sox9的表達(dá)來(lái)抑制人MSCs的軟骨分化。Yang等［21］在研究鼠胚胎MSCs（C3H10T1/2細(xì)胞系）軟骨分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miR?145下調(diào)靶基因Sox9表達(dá)，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因Col2a1、Acan（蛋白聚糖）、Col9a2、Col11a1的mRNA水平降低。在人骨髓MSCs（hM?SCs）成軟骨分化和人的軟骨肉瘤細(xì)胞中miR?449a通過(guò)下調(diào)靶基因Lef1（Wnt信號(hào)通路重要組成部分）表達(dá)，使得Ⅱ型膠原和Sox9表達(dá)下調(diào)以及蛋白多糖的生成減少［22］。miR?199a抑制軟骨形成早期標(biāo)志物表達(dá)，如軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、Ⅱ型膠原及Sox9［23］。Sox9作為miR?495和miR?145的靶基因，在MSCs成軟骨分化Wnt/β?catenin和TGF?β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到重要作用。利用基因工程技術(shù)向MSCs轉(zhuǎn)染Sox9基因，通過(guò)上調(diào)Sox9表達(dá)來(lái)提高M(jìn)SCs成軟骨分化潛能，這種在基因組水平調(diào)控干細(xì)胞軟骨分化的技術(shù)已經(jīng)成為目前及未來(lái)研究的熱點(diǎn)。Song等［24］利用TGF?β3對(duì)雞的肢體MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)軟骨分化，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎上調(diào)表達(dá)的miR?181b出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步的研究表明miR?181b是軟骨發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，抑制miR?181b的表達(dá)或許可以用于治療軟骨相關(guān)疾病。Hou等［25］對(duì)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨分化，揭示miR?193b通過(guò)靶定TGF?β2和TGFBR3（TGF?β re?ceptor 3）來(lái)負(fù)向調(diào)控TGF?β信號(hào)通路，最終抑制干細(xì)胞早期的軟骨分化。

三、正向調(diào)控MSCs成軟骨分化的miRNA

Lin等［26］在研究鼠的MSCs軟骨分化中發(fā)現(xiàn)miR?335?5p和它的宿主基因Mest共表達(dá)，miR?335?5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)MSCs軟骨細(xì)胞分化。miR?335?5p靶向Daam1和ROCK1，后兩者均為Sox9的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Sox9下調(diào)miR?29a和miR?29b的表達(dá)，后兩者為Mest負(fù)調(diào)節(jié)因子。因此從miR?335?5p→Sox9→Mest/miR?335?5p形成了一個(gè)正反饋，循環(huán)促進(jìn)軟骨分化。然而，研究人員并未對(duì)此循環(huán)通路的作用及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究，并且研究對(duì)象局限于鼠的MSCs。Karlsen等［27］的體外BMSCs軟骨分化實(shí)驗(yàn)表明miR?140通過(guò)上調(diào)Sox9和Acan表達(dá)水平，促進(jìn)hMSCs軟骨分化。RALA（v?ral白血病致病因子）被確認(rèn)是miR?140的一個(gè)靶基因，軟骨分化過(guò)程中被抑制的RALA導(dǎo)致Sox9表達(dá)上調(diào)。研究人員發(fā)現(xiàn)RALA抑制Sox9蛋白翻譯，而不影響Sox9的mRNA轉(zhuǎn)錄，RALA與Sox9作用關(guān)系仍不清楚。Barter等［28］通過(guò)研究hMSCs成軟骨分化證明miR?140?5p是調(diào)控軟骨生成主要的miRNA，且miR ?140?5p調(diào)控與骨骼系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的Wnt信號(hào)通路。Ham等［29］研究得出H?89（PKA抑制劑）和miR?23b通過(guò)下調(diào)PKA信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，并認(rèn)為在MSCs軟骨分化過(guò)程中H?89誘導(dǎo)miR?23b表達(dá)。Ham等［30］從上述研究結(jié)果得到啟發(fā)后，對(duì)轉(zhuǎn)染H?89和（或）miR?23b關(guān)節(jié)液來(lái)源的MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)軟骨分化，顯示轉(zhuǎn)染組軟骨分化增加，通過(guò)上調(diào)miR?23b表達(dá)來(lái)抑制PKA信號(hào)通路可以提高自體軟骨治療的潛能。老化的MSCs分化潛能降低，Li等［31］發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的miR?10a通過(guò)靶向Kruppel樣因子4（Kruppel?like factor 4，KLF4）增加老化的MSCs成脂肪、成骨及成軟骨分化能力。

四、其他差異性表達(dá)的miRNA

Han等［32］對(duì)骨髓來(lái)源MSCs體外誘導(dǎo)軟骨分化過(guò)程中的miRNA表達(dá)差異進(jìn)行分析，篩選出4種（miR?130b、miR?152、miR?28、miR?26b）差異性表達(dá)的miRNA，但未對(duì)差異性表達(dá)的miRNA逐一進(jìn)行功能、靶基因及干細(xì)胞成軟骨分化調(diào)控的研究。Zhang等［33］對(duì)脂肪來(lái)源的MSCs體外誘導(dǎo)軟骨分化前后的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，顯示12種miRNA在誘導(dǎo)分化前后存在明顯差異性表達(dá)，其中包括8種上調(diào)表達(dá)的miRNA：miR?193b、miR?199a?3p、miR?455?3p、miR?210、miR?381、miR?92a、miR?320c及miR?136，及4種下調(diào)表達(dá)的miRNA：miR?490?5p、miR?4287、miR?BART8和miR?US25?1。隨后研究人員對(duì)差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，這些靶基因可能參與干細(xì)胞成軟骨分化、增殖、凋亡，以及介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路。Yang等［34］對(duì)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行相似的研究，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞成軟骨分化中12種上調(diào)表達(dá)的miRNA：miR?196a、miR?143、miR?383、miR?193b、let?7i、miR?26a、miR?539、miR?199a?3p、miR?337?5p、miR?146a?5p、miR?646及miR?381，8種下調(diào)表達(dá)的miRNA：miR?490?5p、miR?1307、miR?125b、miR?96?3p、miR?302?3p、miR?23a?3p、miR?590及miR?510，其中部分差異性表達(dá)的miRNA與Zhang的研究是相吻合的。隨后研究者對(duì)差異表達(dá)顯著的miR?196a和miR?490?5p進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR?490?5p的表達(dá)可以提高Col2a1、Col10a1及蛋白聚糖表達(dá)，骨形態(tài)蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2）為miR?490?5p直接靶基因。Buechli等［35］揭示了miR?140在正常馬的軟骨及馬臍血來(lái)源MSCs軟骨分化14 d后的高表達(dá)。miR?140是一個(gè)軟骨發(fā)育和穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)因子，CXCL12（趨化因子配體-12）和ADAMTS?5（蛋白聚糖酶-2）是miR?140靶基因。Laine等［36］在對(duì)骨髓來(lái)源的MSCs誘導(dǎo)分化成軟骨中區(qū)別性地表達(dá)的miRNA分析后，發(fā)現(xiàn)miR?96在成軟骨中表達(dá)不增加，而miR?199a在成軟骨中被上調(diào)。Yang等［37］對(duì)鼠的MSCs軟骨分化四個(gè)不同階段實(shí)施miRNA微陣列，發(fā)現(xiàn)2個(gè)miRNA簇，miR?143/145和miR?132/212，在MSCs軟骨分化中持續(xù)下調(diào)。

MSCs軟骨分化是一個(gè)較為復(fù)雜的生物過(guò)程，這其中涉及眾多轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子及信號(hào)通路相互作用共同完成。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控軟骨分化過(guò)程中相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路分子，以此調(diào)控干細(xì)胞軟骨分化。但往往一個(gè)miRNA有多個(gè)潛在靶基因，而一個(gè)潛在靶基因又受到多個(gè)miRNA調(diào)控，這表明miRNA在干細(xì)胞軟骨分化過(guò)程中存在著復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)miRNA在MSCs軟骨分化過(guò)程的調(diào)控機(jī)制的研究，不僅有助于闡明干細(xì)胞分化分子機(jī)制，而且可以通過(guò)操縱相關(guān)miRNA來(lái)提高M(jìn)SCs成軟骨分化潛能，最終為軟骨修復(fù)帶來(lái)新的希望。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（81572198），廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313772）

518000廣東深圳，安徽醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院（楊坤、王大平）；深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊坤、解磊、朱偉民、黃江鴻、段莉、王大平）

王大平，E?mail：dapingwang1963@qq.com

2015?09?14）