黃江鴻　楊雷　廖福朋　段莉　陳潔琳　王大平　熊建義

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

低氧誘導(dǎo)因子-1α誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合納米人工骨修復(fù)兔橈骨缺損

黃江鴻楊雷廖福朋段莉陳潔琳王大平熊建義

目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）復(fù)合納米羥基磷灰石（nano?hydroxyapatite，nano?HA）人工骨修復(fù)兔橈骨缺損的效果。方法取兔脛骨的骨髓分離培養(yǎng)并鑒定BMSCs；制備攜帶HIF?1α的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，感染BMSCs后與nano?HA共培養(yǎng)得到HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA人工骨材料。將30 只2月齡新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組，每組10只，均通過(guò)手術(shù)截骨后制成橈骨骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)組填充HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA人工骨材料，對(duì)照組填充BMSCs/nano?HA，空白組不填充任何材料。于術(shù)后4、8、12周攝X線(xiàn)片觀察骨缺損處，并于術(shù)后12周獲得兔橈骨的大體標(biāo)本和病理切片，比較橈骨缺損的愈合情況。結(jié)果經(jīng)鑒定，分離培養(yǎng)得到的BMSCs形態(tài)良好，高表達(dá)CD90、CD105；所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的橈骨中段缺損模型均構(gòu)建成功，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的大體標(biāo)本、X線(xiàn)片及病理切片進(jìn)行比較分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的骨缺損均有所修復(fù)，但實(shí)驗(yàn)組的新骨形成量更大，骨缺損修復(fù)能力優(yōu)于對(duì)照組，空白組骨缺損區(qū)未能得到修復(fù)。結(jié)論HIF?1α誘導(dǎo)分化的BMSCs與nano?HA復(fù)合制成的HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨具有良好的骨缺損修復(fù)能力，可能成為一種理想的骨缺損修復(fù)材料。

低氧誘導(dǎo)因子；間充質(zhì)干細(xì)胞；羥基磷灰石；骨代用品

骨缺損是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，主要表現(xiàn)為骨結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，是目前骨科臨床治療的難題之一。創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因［1］。如何對(duì)各種原因引起的骨缺損進(jìn)行有效的修復(fù)是現(xiàn)階段研究的主要方向。

低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia?inducible factor?1，HIF?1）是Semenza等［2］于1992年發(fā)現(xiàn)的一種氧依賴(lài)轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)與低氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，引發(fā)下游基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)對(duì)其下游靶基因的誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控血管生成、能量代謝、細(xì)胞增殖遷移分化等反應(yīng)［3，4］。大量體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道都證實(shí)了HIF ?1α在促進(jìn)血管化及成骨化方面有著積極的作用。張勁娥等［5］構(gòu)建了野生型和點(diǎn)突變型HIF?1α基因慢病毒真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染后可促進(jìn)兔BMSCs成骨基因的表達(dá)。Ding等［6］將HIF?1α基因轉(zhuǎn)染到BMSCs中，并移植入早期激素性股骨頭壞死家兔模型中，結(jié)果表明HIF?1α基因轉(zhuǎn)染可提高離體骨髓細(xì)胞成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，在體外增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，在體內(nèi)增強(qiáng)血管生成活性，說(shuō)明HIF?1α轉(zhuǎn)基因自體骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)移可以促進(jìn)激素性股骨頭壞死區(qū)的修復(fù)。

BMSCs是存在于骨髓中的一類(lèi)非造血干細(xì)胞，在一定條件下可定向分化為多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞等［7?9］。納米羥基磷灰石（nano?hydroxyapatite，nano?HA）是目前應(yīng)用廣泛的一種生物活性材料，具有良好的骨傳導(dǎo)性和生物相容性。本研究將重組HIF?1α慢病毒質(zhì)粒感染BMSCs后，與nano?HA人工骨復(fù)合培養(yǎng)，使骨修復(fù)材料具備良好骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)合人工骨的修復(fù)能力進(jìn)行檢測(cè)，以此解決人工骨修復(fù)材料在骨缺損區(qū)與周邊自體骨之間有效“骨整合”的難題，從而為臨床修復(fù)骨缺損提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料與試劑

慢病毒HIF?1α表達(dá)質(zhì)粒、293T細(xì)胞、nano?HA人工骨（孔隙直徑為150～300 μm、孔隙率為92%以上）由深圳市第二人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室制備提供；新西蘭大白兔，雄雌不限，2月齡（2 kg左右），由深圳市疾病預(yù)防控制中心提供。

Lenti?Pac HIV表達(dá)包裝試劑盒（GeneCopoeia公司，美國(guó)），H?DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液（HyClone公司，美國(guó)），Opti?MEMI、0.25%Trypsin?EDTA、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素+鏈霉素）、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜（Gibco公司，美國(guó)），Anti?CD90/FITC、Anti?CD105/ FITC、Anti?CD45/FITC、Anti?CD34/FITC、維生素C、3-甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、戊巴比妥鈉、番紅、素木精、快綠（Sigma公司，美國(guó)）。

二、兔BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

1.分離和培養(yǎng)新西蘭大白兔靜脈注射2%戊巴比妥鈉，全身麻醉，局部去毛、消毒，于兔后腿股骨大轉(zhuǎn)子處行骨髓穿刺，將5 ml注射器預(yù)裝0.1 ml肝素，抽取約3 ml骨髓。離心、洗滌。將洗滌后的細(xì)胞懸液加入5 ml含有10%FBS、1%雙抗的H?DMEM培養(yǎng)液中，置于直徑75 mm的培養(yǎng)皿中，5%CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，之后每2～3 d換液1次。

2.形態(tài)鑒定待貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞集落達(dá)到85% ～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.表面標(biāo)記鑒定取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔BMSCs。洗滌，離心，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入20 μlanti?CD90/FITC、Anti?CD105/FITC、Anti?CD45/FITC、Anti?CD34/FITC，避光室溫孵育20 min，PBS液洗滌細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min。加入PBS液400 μl，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，使用Beckman Coulter軟件采集數(shù)據(jù)。

三、慢病毒包裝及滴度測(cè)定

取長(zhǎng)勢(shì)良好、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的293T細(xì)胞，37℃、5%CO2飽和濕度條件下接種、孵育。取HIF?1α質(zhì)粒10 μl，按Lenti?Pac HIV表達(dá)包裝試劑盒步驟操作。48 h后收集培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞雜質(zhì)碎片，即獲得包含慢病毒載體顆粒的培養(yǎng)基溶液。

采用PEG法濃縮病毒顆粒，并測(cè)定病毒滴度，病毒滴度=感染細(xì)胞數(shù)×GFP陽(yáng)性率×病毒稀釋倍數(shù)/病毒量。

四、HIF?1α慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs

（1）取生長(zhǎng)狀況良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM?SCs，消化，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液。

（2）將細(xì)胞懸液接種在6孔板中，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約為5×104個(gè)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度約為85%時(shí)進(jìn)行下一步操作。

（3）用24孔板預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置MOI值（病毒與需要感染的細(xì)胞數(shù)的比值）分別為1、2、5、10、20、50、100的7個(gè)感染組，確定最佳MOI值為50 TU/cell。

（4）根據(jù)病毒滴度配置相應(yīng)濃度的病毒稀釋液和對(duì)照eGFP的病毒稀釋液。

（5）轉(zhuǎn)染前吸棄各組培養(yǎng)液，PBS清洗1次。實(shí)驗(yàn)組中加入2 ml病毒稀釋液，對(duì)照組中加入2 ml eGFP病毒稀釋液，空白組中加入2 ml培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)孵育48 h。

（6）倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

五、復(fù)合人工骨材料制備

（1）將nano?HA人工骨材料大小裁剪為8 mm× 3 mm×3 mm大小，在75%乙醇內(nèi)浸泡30 min，PBS中浸泡1 h，上述過(guò)程重復(fù)3次，紫外線(xiàn)下照射1 h。

（2）將消毒后的nano?HA浸潤(rùn)在含兔BMSCs培養(yǎng)基的6孔板內(nèi)24 h，以充分濕潤(rùn)材料表面及內(nèi)部。

（3）取轉(zhuǎn)染HIF?1α后的BMSCs，消化，離心，沉淀，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/ ml，接種到6孔板中已潤(rùn)濕的nano?HA材料表面。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后將材料翻面再次接種細(xì)胞，每次接種時(shí)nano?HA材料要求被細(xì)胞懸液浸透。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，制備得到HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨。

（4）同理，將未轉(zhuǎn)染HIF?1α的BMSCs種植到na?no?HA表面，得到BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨。

六、不同人工骨修復(fù)兔橈骨骨缺損

采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只健康2月齡新西蘭大白兔平均分為3組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組）。

所有實(shí)驗(yàn)兔于實(shí)驗(yàn)前禁食8 h，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）行全身麻醉。在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上常規(guī)固定實(shí)驗(yàn)兔，備皮消毒和鋪巾，分別取其雙耳橈側(cè)皮膚表面中段作1.5 cm縱行切口，仔細(xì)分離皮下組織，充分暴露橈骨干。于中段用線(xiàn)鋸截骨后制成1.0 cm橈骨骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)組植入HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨，對(duì)照組植入BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨，空白組不植入。予生理鹽水反復(fù)沖洗術(shù)區(qū)，徹底止血，肌肉組織包埋，逐層縫合創(chuàng)口，加壓包扎無(wú)菌敷料。麻醉清醒后分組放入兔籠，單籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。術(shù)后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)兔肌注雙抗，2×105U/次，1次/d，共3 d。無(wú)菌飼料室溫喂養(yǎng)，潔凈飲水，自由活動(dòng)。

觀察各組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后的飲食、活動(dòng)、步態(tài)及傷口感染、愈合情況，于術(shù)后12周取標(biāo)本時(shí)觀察植入材料表面情況、骨缺損處的骨痂形成、斷端髓腔再通情況。術(shù)后4、8、12周分別對(duì)所有實(shí)驗(yàn)兔的手術(shù)部位進(jìn)行X線(xiàn)檢查，觀察材料吸收和骨愈合情況。于術(shù)后12周，用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，手術(shù)取出雙側(cè)橈骨標(biāo)本。截取骨缺損修復(fù)處及上下緣約5 mm正常橈骨組織，福爾馬林固定，依次進(jìn)行脫鈣、脫水、透明、包埋等常規(guī)骨質(zhì)切片處理，每組5個(gè)樣本，HE染色，觀察關(guān)節(jié)骨缺損處骨痂形成及骨材料降解情況。

圖1　倒置顯微鏡（×100）下，第1代BMSCs（a）和第3代BMSCs（b）的形態(tài)

結(jié)果

一、慢病毒包裝

以慢病毒Lenti?HIF?1α?eGFP和Lenti?Pac HIV混合包裝質(zhì)粒為載體成功感染293T細(xì)胞，收集、濃縮、量化，得出病毒滴度為7.8×109IU/ml。

二、兔BMSCs的鑒定

經(jīng)全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)獲得的兔BMSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，有生長(zhǎng)暈，立體感強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)，表現(xiàn)為平行或漩渦狀分布。在倒置顯微鏡下，BMSCs形態(tài)均一，呈梭形（圖1）。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示第3代BMSCs表面強(qiáng)表達(dá)特異性抗原CD90、CD105（陽(yáng)性率為99.3%，圖2a），不表達(dá)造血干細(xì)胞表面特異性抗原CD34、CD45（圖2b），表明BMSCs培養(yǎng)成功。

三、慢病毒載體感染BMSCs的效率

用50 MOI病毒感染BMSCs，48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，約有80%細(xì)胞熒光表達(dá)呈陽(yáng)性（圖3），表明細(xì)胞的感染效率為80%左右。

四、實(shí)驗(yàn)兔的一般情況

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的橈骨中段缺損模型均構(gòu)建成功，每組動(dòng)物術(shù)后一周活動(dòng)較少，1周后活動(dòng)、飲食均恢復(fù)正常，精神狀態(tài)活躍，傷口愈合良好，皮下和肌肉組織無(wú)充血、腫脹、滲出、傷口感染，植入材料無(wú)裸露，正常肢體活動(dòng)較好，無(wú)跛行，無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

五、大體標(biāo)本形態(tài)觀察

術(shù)后12周獲得3組兔的橈骨標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組材料完全降解，被骨痂及骨組織填充，形成骨性連接，表面連續(xù)平整，骨缺損基本修復(fù)（圖4a）；對(duì)照組材料部分降解，缺損區(qū)充滿(mǎn)骨痂組織，與正常骨組織連接較緊密，界面不明顯，骨缺損部分修復(fù)（圖4b）；空白組可見(jiàn)兩斷端骨質(zhì)硬化，未見(jiàn)明顯骨痂生長(zhǎng)，與尺骨部分連接，骨缺損未能得到修復(fù)（圖4 c）。

六、X線(xiàn)表現(xiàn)

1.實(shí)驗(yàn)組4周時(shí)材料部分降解，薄云霧狀陰影出現(xiàn)在正常骨組織連接處，邊界變模糊，周?chē)丘栊纬闪慷啵▓D5a）；8周時(shí)材料大部分降解，與骨質(zhì)交界處結(jié)合更緊密，分界不清、模糊，并可見(jiàn)較高密度骨痂影，大量骨痂生成，新骨向中央處生長(zhǎng)（圖5b）；12周時(shí)材料完全降解，長(zhǎng)出新生骨組織，骨髓腔再通，骨折線(xiàn)融合，骨缺損基本修復(fù)（圖5 c）。

2.對(duì)照組4周時(shí)材料少部分降解，與正常骨組織邊界模糊，有小片的云霧狀陰影，骨痂形成量少（圖5 d）；8周時(shí)材料降解不多，骨缺損部位連接少量骨痂（圖5 e）；12周時(shí)材料部分降解，邊界模糊，缺損區(qū)形成分布不均勻的連續(xù)性骨痂，骨髓腔部分再通，骨缺損處部分修復(fù)（圖5 f）。

3.空白組12周時(shí)骨缺損區(qū)無(wú)骨性連接，僅見(jiàn)斷端少量骨痂樣陰影，部分與尺骨相接，形成骨不連，骨髓腔未通，骨缺損未能修復(fù)（圖5 g）。

七、組織切片表現(xiàn)

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：第3代BMSCs表面強(qiáng)表達(dá)特異性抗原CD90、CD105（a），不表達(dá)造血干細(xì)胞表面特異性抗原CD34、CD45（b）

圖3　Lenti?HIF?1α?eGFP感染兔BMSCs 48 h后，普通顯微鏡視野（×200，a）及熒光顯微鏡視野（×200，b），約有80%細(xì)胞熒光表達(dá)呈陽(yáng)性

1.實(shí)驗(yàn)組植入材料完全降解，皮質(zhì)骨形成，分布稍不規(guī)則，可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞及少量纖維結(jié)締組織，骨髓腔重新貫通，可見(jiàn)部分骨髓組織生成，有多量脂肪組織，骨缺損基本修復(fù)（圖6a）。

2.對(duì)照組植入材料部分降解，少量新生骨組織填充缺損區(qū)，骨髓腔未完全形成，缺損部分修復(fù)（圖6b）。

3.空白組骨缺損區(qū)僅有少量骨痂及纖維結(jié)締組織生成，髓腔兩端封閉，骨缺損未能修復(fù)（圖6 c）。

圖4　術(shù)后12周，觀察組標(biāo)本新骨形成，材料完全吸收，骨缺損基本修復(fù)（a）；對(duì)照組標(biāo)本中材料部分降解，骨缺損部分修復(fù)（b）；空白組標(biāo)本中兩斷端骨質(zhì)硬化，骨缺損未修復(fù)（c）

圖5　各組實(shí)驗(yàn)兔橈骨不同時(shí)間點(diǎn)的X線(xiàn)片

討論

一、HIF?1α基因在骨缺損修復(fù)中的成骨作用

HIF?1α是HIF?1的活性亞基，同時(shí)又作為HIF?1的調(diào)節(jié)亞基，其空間構(gòu)象穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄活性與細(xì)胞內(nèi)氧濃度有關(guān)［10，11］。作為一種非常有效的細(xì)胞因子，HIF?1α通過(guò)調(diào)控其下游基因的表達(dá)，促進(jìn)血管生成、加速成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并提供養(yǎng)分促使干細(xì)胞成骨分化。HIF?1α可直接或間接促進(jìn)成骨因子（如BMP2）生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和新生血管形成，促進(jìn)BMSCs的細(xì)胞增殖和分化，在骨缺損的成骨細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

二、BMSCs的成骨誘導(dǎo)分化作用

BMSCs為多向分化潛能的干細(xì)胞，可誘導(dǎo)成骨、成軟骨，來(lái)源廣泛、取材方便，對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生的創(chuàng)傷小，操作簡(jiǎn)便，易分離培養(yǎng)，在體外仍可保持多分化的潛能，植入缺損部位可高度增殖且不引起免疫排斥反應(yīng)，可誘導(dǎo)分化成骨、軟骨、血管等多種組織，從而參與骨缺損的修復(fù)以及組織的再生，是目前骨組織工程中的較為理想的種子細(xì)胞［12］。

本研究通過(guò)直接離心貼壁分離培養(yǎng)BMSCs，光鏡和電鏡下觀察BMSCs的生長(zhǎng)、傳代以及與材料黏附情況，從細(xì)胞形態(tài)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原兩方面進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示從新鮮兔骨髓穿刺液中分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞具有BMSCs的一般生物學(xué)特性［13，14］：細(xì)胞為典型的梭形或多角形，呈漩渦狀貼壁生長(zhǎng)，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性抗原CD90、CD105，陰性表達(dá)CD34、CD45。

三、HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA的修復(fù)力

骨移植材料的轉(zhuǎn)歸取決于材料自身性質(zhì)、與新生骨質(zhì)及周?chē)M織的相互作用。移植材料的骨傳導(dǎo)作用在骨缺損修復(fù)過(guò)程發(fā)揮起關(guān)鍵作用［17］。即移植材料作為類(lèi)似橋梁支架作用，為周?chē)难芎图?xì)胞生長(zhǎng)提供平臺(tái)，隨著新骨組織形成、移植材料也逐漸被降解吸收。骨修復(fù)材料移植后，在體內(nèi)發(fā)生一系列組織及生物學(xué)改變［18］：①機(jī)體骨床的微小血管向骨修復(fù)材料內(nèi)部生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)周?chē)腂MSCs向支架內(nèi)遷徙、增殖；②骨修復(fù)材料表面附著的BMSCs與機(jī)體內(nèi)的BMSCs共同參與造骨過(guò)程；③骨修復(fù)材料隨著組織的生長(zhǎng)，在細(xì)胞及內(nèi)環(huán)境作用下逐漸分解并吸收，而在缺損部位形成的新骨組織也逐漸替代骨修復(fù)材料，完成骨質(zhì)的連續(xù)性和重新塑形。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組的X線(xiàn)結(jié)果顯示nano?HA人工骨材料完全降解，單純的nano?HA本身為不可降解材料，但是nano?HA與BMSCs復(fù)合則形成了可吸收的nano?HA人工骨材料，由于nano?HA具有良好的生物相容性，有利于BMSCs細(xì)胞黏附和細(xì)胞因子等物質(zhì)的親和。而且nano?HA具有龐大粗糙的表面積，為BMSCs細(xì)胞的黏附、增殖和分化提供了良好的場(chǎng)所，有助于HIF?1α及其下游基因的持續(xù)表達(dá)。再者nano?HA的多孔結(jié)構(gòu)有利于血管的生產(chǎn)和伸展，促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的遷移、增殖，并保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和廢物的排泄通暢，為細(xì)胞在材料內(nèi)生長(zhǎng)及表達(dá)HIF?1α提供了營(yíng)養(yǎng)支持。正是因?yàn)閚ano?HA的孔隙結(jié)構(gòu)以及納米材料本身所特有的“納米效應(yīng)”，極大地增加了材料的表面積，為骨基質(zhì)的形成以及鈣鹽沉積提供了良好的支架結(jié)構(gòu)，所以構(gòu)建的nano?HA人工骨在體內(nèi)逐漸被新生骨組織降解吸收，從而達(dá)到修復(fù)骨缺損的良好效果［19］。

HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA復(fù)合人工骨材料，通過(guò)無(wú)機(jī)成分nano?HA，增加復(fù)合材料的骨傳導(dǎo)性能。首先機(jī)體新生骨痂、微小血管通過(guò)爬行作用將人工骨包裹，使之起到充填和連接骨缺損的作用。其次人工骨中的空隙多孔結(jié)構(gòu)有利于周?chē)募?xì)胞、毛細(xì)血管的附著和增生，逐漸分化為新骨組織，同時(shí)nano?HA逐漸分解，最終被新骨組織替代。HIF ?1α?eGFP/BMSCs成分主要通過(guò)HIF?1α促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)調(diào)控其下游基因的表達(dá)，利于骨缺損處的成骨分化及血管再生，為BMSCs提供良好的細(xì)胞外環(huán)境，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。

圖6　各組實(shí)驗(yàn)兔的組織病理切片（HE染色，×100）

［1］Macchiarini P，Jungebluth P，Asnaghi MA，etal.Clinical transplan?tation ofa tissue?engineeredairway［J］.Lancet，2008，372（9655）：2023?2030.

［2］Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor inducedby hypoxia via de novo protein synthesisbinds to the human erythropoietin gene enhancerata site required for transcriptionalactivation［J］.Mol Cellbiol，1992，12（12）：5447?5454.

［3］Chen K，Shi P，Teh TK，etal.In vitro generation ofa multilayered osteochondral construct withan osteochondral interface using rab?bitbone marrow stromal cellsanda silk peptide?based scaf?fold［J］.J Tissue Eng Regen Med，2013.［Epubahead of print］

［4］LinbN，Whu SW，Chen CH，etal.Bone marrow mesenchymal stem cells，platelet?rich plasmaand nanohydroxyapatite?type I col?lagenbeads were integral parts ofbiomimeticbone substitutes forbone regeneration［J］.J Tissue Eng Regen Med，2013，7（11）：841?854.

［5］張勁娥，王淑紅，張忻，等.低氧誘導(dǎo)因子1α慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨基因表達(dá)［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18（1）：57?62.

［6］Ding H，Gao YS，Hu C，etal.HIF?1α transgenicbone marrow cells can promote tissue repair in cases of corticosteroid?induced osteo?necrosis of the femoral head in rabbits［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63628.

［7］Huri PY，Huri G，Yasar U，etal.Abiomimetic growth factor deliv?ery strategy for enhanced regeneration of iliac crest defects［J］.biomed Mater，2013，8（4）：045009.

［8］Kim TH，Oh SH，Chun SY，etal.Bone morphogenetic proteins?im?mobilized polydioxanone porous particlesasanartificialbone graft［J］.Jbiomed Mater Resa，2014，102（5）：1264?1274.

［9］Song X，Liu S，Qu X，etal.BMP2and VEGF promoteangiogenesisbut retard terminal differentiation of osteoblasts inbone regenera?tionby up?regulating Id1［J］.Actabiochimbiophys Sin（Shang?hai），2011，43（10）：796?804.

［10］Xia Y，Choi HK，Lee K.Recentadvances in hypoxia?inducible fac?tor（HIF）?1 inhibitors［J］.Eur J Med Chem，2012，49（1）：24?40.

［11］Liu D，Hu L，Zhang Z，etal.Construction of humanbMP2?IRES?HIF1αmuadenovirus expression vectorand its expression in mes?enchymal stem cells［J］.Mol Med Rep，2013，7（2）：659?663.

［12］L?fgren H，Engquist M，Hoffmann P，etal.Clinicaland radiolog?ical evaluation of Trabecular Metaland the Smith-Robinson tech?nique inanterior cervical fusion for degenerative disease：a pro?spective，randomized，controlled study with 2?year follow?up［J］. Eur Spine J，2010，19（3）：464?473.

［13］Chae KS，Kang MJ，Lee JH，etal.Opposite functions of HIF?α iso?forms in VEGF inductionby TGF?β1 under non?hypoxic condi?tions［J］.Oncogene，2011，30（10）：1213?1228.

［14］李秀森，郭子寬，楊靖清.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2000，25（5）：346.

［15］Escors D，Breckpot K.Lentiviral vectors in gene therapy：their cur?rent statusand future potential［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2010，58（2）：107?119.

［16］Schambacha，Zychlinski D，Ehrnstroemb，etal.Biosafety fea?tures of lentiviral vectors［J］.Hum Gene Ther，2013，24（2）：132?142.

［17］Webster TJ，Ergun C，Doremus RH，etal.Enhanced osteoclast?like cell functions on nanophase ceramics［J］.Biomaterials，2001，22（11）：1327?1333.

［18］Murphy WL，Simmons CA，Kaigler D，etal.Bone regeneration viaa mineral substrateand inducedangiogenesis［J］.J Dent Res，2004，83（3）：204?210.

［19］Kaigler D，Wang Z，Horger K，etal.VEGF scaffolds enhancean?giogenesisandbone regeneration in irradiated osseous defects［J］. Jbone Miner Res，2006，21（5）：735?744.

HIF?1α?inducedbone marrow mesenchymal stem cells combined with complex nano?artificialbone re?pairing rabbitbone defects.

HUANG Jianghong，Y
ANG Lei，LIAO Fupeng，DUAN Li，CHEN Jielin，WANG Daping，XIONG Jianyi.National Key Orthopaedic Department，Shenzhen Second People's Hospital；Shenzhen Tissue Engineering Key Laboratory，Shenzhen 518035，China

XIONG Jianyi，E?mail：jianyixiong@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of theartificialbone which composedby hypoxia?inducible factor?1α（HIF?1α）?inducedbone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）and nano?hydroxyapatite （nano?HA）in repairing rabbit radius defect.MethodsThebMSCs were isolated from the tibia of rabbits，cul?turedand identified.The lentivirus of HIF?1α was preparedand HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HAartificialbone material was producedby co?culturingbMSCs infected with HIF?1α lentivirusand nano?HA.Thirty New Zea?land white rabbits were divided into 3 groupsat random.The radialbone defect model was establishedby surgi?cal osteotomy.The radius defects in experimental group were filled with HIF?1α?eGFP/BMSCs/nano?HA，those in control group withbMSCs/nano?HA，and those inblank group with nothing.Thebone defect was observedat 4th，8thand 12th weekafter operationby X?ray examination，and the healing of radial defect was compared grosslyand pathologicallyat 12th weekafter operation.ResultsThebMSCs had good formand high expres?sion of CD90and CD105.The radialbone defect models were successfully constructed.Thebone defects in ex?perimental groupand control group healed to some extent，but the newbone formation in the experimental group was greater，and the repairability wasbetter than in the control group.ConclusionThe HIF?1α?eGFP/BM?SCs/nano?HA compositeartificialbone processesa goodability to repair thebone defect，and is expected tobe?comean ideal material for repairingbone defect.

Hypoxiainducible factor；Mesenchymal stem cells；Hydroxyapatites；Bone substitutes

·骨科護(hù)理·

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.03.013

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目（CXZZ20140813160132596，JCYJ20130401112820839）

518035廣東深圳，深圳市第二人民醫(yī)院骨科、深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

熊建義，E?mail：jianyixiong@126.com

2015?09?04）