葛茸茸，沈奕伶，高　玉

·綜述與講座·

視網(wǎng)膜母細胞瘤基因治療的研究進展

葛茸茸，沈奕伶，高玉

[關鍵詞]視網(wǎng)膜母細胞瘤；基因治療；研究進展

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)來源于光感受器前體細胞，是小兒最常見、危害性最大的眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴重威脅患兒的視力甚至生命，其發(fā)病率約為1/15 000～1/20 000，多見于嬰幼兒，6歲以前發(fā)現(xiàn)病情者占絕大多數(shù)[1]。RB早期可不影響視力，腫瘤一般體積很小且位于視網(wǎng)膜周邊部，很難及時、準確地發(fā)現(xiàn)，容易漏診。多數(shù)患兒是在眼部出現(xiàn)癥狀以后才被注意，而此時確診，大多已是中晚期。傳統(tǒng)的治療主要是單獨或聯(lián)合應用眼球摘除術、外照射放射治療、局部治療等方法；化學減容法是保守治療的主要方法之一；局部治療主要有激光光凝、經(jīng)瞳孔溫熱療法、光動力療法、冷凍治療、鞏膜敷貼放療等。但上述方法往往缺乏針對性，存在特異性的破壞性損傷，安全性低、全身和/或局部不良作用嚴重，甚至發(fā)生腫瘤種植、誘發(fā)第二惡性腫瘤等諸多問題[2]。隨著腫瘤分子生物學與基因工程技術的發(fā)展，加之眼球作為靶組織獨具的解剖優(yōu)勢，在RB治療領域，基因治療作為一種新型生物治療手段，呈現(xiàn)出良好的應用前景?，F(xiàn)將近年來RB基因治療的研究進展作一綜述。

1RB基因替代療法

RB的發(fā)病與Rb基因的缺失或失活密切相關。Rb基因是隨著RB的研究而最早被發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其蛋白質產(chǎn)物在人體內(nèi)發(fā)揮著諸如調(diào)節(jié)分化、轉錄、細胞周期等重要作用。Rb基因與其蛋白表達物的失活會導致細胞分裂不受控制地、非正常地增長而發(fā)生永生化，最終引發(fā)腫瘤。對于家族遺傳性患者，其出生前生殖細胞中的Rb基因已經(jīng)發(fā)生過一次突變，還有一個正常的等位基因沒有發(fā)生突變，但該正常等位基因通常會由于偶然的原因失活，進而引發(fā)癌癥；對于非家族性遺傳患者而言，需要發(fā)生兩次突變才會發(fā)病，這種幾率相對較低；其他的突變類型包括無功能突變、啟動子突變等。針對缺失或失活Rb基因的治療策略，不僅對患病個體的臨床治療有重要作用，對患病個體的兄弟姐妹以及后代患病狀況的監(jiān)測同樣具有重要意義。Xu等[3]的研究顯示，將外源性Rb基因導入RB細胞，替代其缺陷Rb基因，能有效抑制腫瘤細胞生長，同時還能抑制腫瘤細胞永生化所必需的端粒酶活性，進而導致RB腫瘤細胞死亡。但目前，RB基因替代療法的作用僅限于被轉染的腫瘤細胞，如何改進治療基因的傳遞載體、提高腫瘤細胞的轉染效率，已成為其療效的關鍵點。RB有很高的自發(fā)退變率，是其他惡性腫瘤的近千倍[4]，這似乎預示著腫瘤完全有可能被攻克。人體細胞自身就存在對腫瘤細胞生長具有拮抗作用的抑癌基因等相關因子，能否揭示RB發(fā)病及自發(fā)退變的機制，已成為攻克RB及其他惡性腫瘤的關鍵。

2導入抑癌基因治療

除Rb基因外，p53和p21等抑癌基因的突變與失活，對RB的發(fā)生、發(fā)展，同樣也起著非常重要的作用。p53基因作為與人類腫瘤相關性最高的基因，至今被認為是機體抵抗癌癥的主要防線。自1979年起的十多年時間里，人們對 p53基因的認識，主要經(jīng)歷了癌蛋白抗原、癌基因到抑癌基因等3個階段。目前已經(jīng)公認，具有促進腫瘤形成或細胞轉化作用的p53蛋白，是p53基因突變的產(chǎn)物；野生型p53基因是一種抑癌基因，但在發(fā)生突變或失活后，不僅不能抑制腫瘤增殖，反而會具備癌基因的相關功能。p21基因屬于細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族，在細胞周期控制及腫瘤發(fā)生方面具有重要作用。Audo等[5]將p53和p21分別導入RB細胞，均能抑制腫瘤細胞生長和促進凋亡。國內(nèi)亦有研究顯示[6]，野生型p53基因具有抑制RB細胞生長的作用。p53基因能抑制腫瘤細胞生長、促使腫瘤細胞凋亡，還能幫助細胞基因修復缺陷，但這一功能對于因化療藥物等作用而受傷的腫瘤細胞，卻又起到修復作用，從而造成被修復的腫瘤細胞在治療后成為新的腫瘤。

3自殺基因治療

自殺基因又稱前體藥物酶轉化基因，自殺基因治療的原理是將某些病毒或細菌的基因(既自殺基因)導入腫瘤細胞，該基因表達的酶催化無毒或低毒的藥物前體代謝為細胞毒性物質，干擾受體腫瘤細胞DNA合成，從而引起腫瘤細胞的自殺效應[7]。單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)，既將單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因導入腫瘤細胞，聯(lián)合應用更昔洛韋，進行自殺基因治療，目前被認為是針對玻璃體腔內(nèi)種植性RB最為有效的一種治療方法。Hurwitz等[8]研究表明，含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)聯(lián)合更昔洛韋，能有效殺死人RBY79細胞。張永紅等[9]研究腫瘤特異性雙自殺基因載體pc-ChCDTK對人RBY79細胞的體外殺傷作用，其結果顯示，雙前體藥物的殺傷作用明顯大于單前體藥物。自殺基因治療具有“旁觀者效應”，不僅導入自殺基因的腫瘤細胞自身被殺死，與其臨近或遠處未被轉染的腫瘤細胞，也會因為毒性物質通過細胞間縫隙連接的轉運而被殺死?！芭杂^者效應”彌補了腫瘤細胞轉染效率低的缺陷，有效增強了自殺基因的殺傷效能。正常的免疫系統(tǒng)可能對“旁觀者效應”起著重要作用[10]。自殺基因治療有著良好的應用前景，但要真正用于臨床，諸如對眼內(nèi)正常細胞的不良作用等許多問題還有待深入研究和解決。靶向性傳遞自殺基因至靶細胞，“旁觀者效應”僅對未轉染的腫瘤細胞起作用，可能是自殺基因治療將來的一個重要發(fā)展方向。

4抗血管生成基因治療

腫瘤生長依賴新生血管形成以獲取營養(yǎng)、氧氣及排出廢物；當實體腫瘤直徑達到或超過1～2 mm，由于新生血管的形成與長入，腫瘤組織將迅速生長，其浸潤和轉移能力也將不斷增強，若無新生血管，腫瘤組織則發(fā)生退化[11]。新生血管還能為腫瘤細胞提供轉移通道。抗血管生成基因治療以腫瘤新生血管為靶點，將相關基因轉導入腫瘤及其周圍組織，通過抑制新生血管生成切斷腫瘤生長、轉移所依賴的營養(yǎng)微環(huán)境，既以“饑餓療法”達到殺死腫瘤細胞、治療腫瘤的目的[12]。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，是唯一特異作用于血管內(nèi)皮細胞的血管調(diào)控因子，能直接刺激血管內(nèi)皮細胞增殖、誘導遷移及管腔樣結構形成，還能增加微血管的通透性[13]。有研究證實，VEGF在RB組織中高表達，且能促進RB的惡性進程[14]。以VEGF作為治療靶點的抗血管生成基因治療，已成為目前治療RB的重要策略之一。但腫瘤血管的生成，是促血管生成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用、共同參與的復雜過程，僅針對某個單一血管調(diào)控因子，是很難真正完全性抑制腫瘤血管生成的。即便實體腫瘤因有效治療，體積縮小到一定程度，但幸存腫瘤細胞可從組織間液獲取營養(yǎng)。故而，單純依靠抗血管生成基因治療很難徹底根除腫瘤。抗血管生成基因治療需與化療、放療或手術等其他方法聯(lián)合實施。有觀點認為，血管生長抑制劑和細胞因子免疫療法的聯(lián)合應用，可能成為根治惡性腫瘤的有效手段[15]。

5促凋亡基因治療

黑色素瘤分化相關基因-7(MDA-7)，又被稱為白細胞介素-24(IL-24)，通過抑制血管生成、激活生長抑制DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage,GADD)等途徑，選擇性殺死腫瘤細胞、促進細胞增殖阻滯及誘導細胞凋亡[16]。將編碼MDA-7的腺病毒載體導入RB組織(CB/17SCID鼠皮下RB模型)，腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡，腫瘤體積明顯縮小[17]，MDA-7/IL-24有望成為RB基因治療的重要因子。由于MDA-7蛋白可對周圍未受轉染的腫瘤細胞產(chǎn)生“旁觀者效應”[18]，采用MDA-7的促凋亡基因治療，存在與自殺基因治療類似的毒副作用。

6溶瘤性單純皰疹病毒基因治療

溶瘤病毒基因治療通過病毒在腫瘤細胞內(nèi)的復制增殖，造成腫瘤細胞裂解而殺死腫瘤細胞，細胞裂解后釋放出來的病毒又可進一步感染周圍的腫瘤細胞，具有級聯(lián)放大作用。溶瘤單純皰疹病毒(HSV)是目前抗腫瘤作用最好的一種溶瘤病毒，沉默γ 34.5基因或核糖核苷酸還原酶基因的HSV突變株，能選擇性地在腫瘤細胞中復制，導致腫瘤細胞裂解性死亡[19]。以往曾有多項關于HSV突變株應用于RB治療的報道：HSV突變株對LHβTAg轉基因小鼠RB動物模型的療效有限[20]；其復制僅局限于惡性病灶區(qū)和視網(wǎng)膜色素上皮(病毒抗原免疫組化檢測)[21]。而Kogishi等[22]的體外實驗卻提示，HSV突變株可在人RBY79細胞中復制且具有溶瘤細胞作用。這些研究結果的差異可能與實驗對象(RB細胞、動物模型)的不同有關。由于HSV突變株存在引起受體眼部炎癥、免疫和毒性反應的可能[23]，其應用也受到了一定的限制。

綜上所述，基因治療是通過糾正或補償致病基因的缺陷，關閉或抑制異?；虻谋磉_，而得以實現(xiàn)治療RB的目的。眼內(nèi)微環(huán)境相對獨立于體循環(huán)系統(tǒng)，降低了轉基因載體全身蔓延的幾率，能有效減少甚至避免全身不良反應，相比其他部位的腫瘤，RB選擇基因治療具有一定優(yōu)勢。但在憧憬基因治療應用前景的同時，尚不可忽視，基因治療還不能完全殺死腫瘤細胞，應用于眼局部仍會出現(xiàn)炎癥、免疫和毒性反應，對鄰近RB正常細胞的不良反應仍有待解決，尤其，病毒載體本身及外源基因隨機整合也會給受治者帶來潛在危害。

總之，RB基因治療離真正應用于臨床還有一定距離，隨著科技的進步和研究的深入，基因治療將向著安全性、精密性、靶向性和高效性方向不斷發(fā)展，以基因治療為主體的綜合治療策略將得到不斷完善，最終實現(xiàn)不僅要挽救RB患兒生命、保留眼球，還要保存有用視力以提高其生活質量。

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(本文編輯：莫琳芳)

[作者單位]200081上海，解放軍第四一一醫(yī)院眼科

[中圖分類號]R774.1

[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.040

(收稿日期：2015-12-25)