曹劼

（福建省將樂縣林業(yè)局 353300）

植物體細(xì)胞胚發(fā)生的激素調(diào)控

曹劼

（福建省將樂縣林業(yè)局 353300）

隨著生物科技的不斷發(fā)展，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的技術(shù)隨之興起，該技術(shù)的應(yīng)用不僅讓植物快速繁殖的目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)為植物胚胎發(fā)生機(jī)理、遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的形成提供了幫助。本文通過植物五大激素對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控及其作用機(jī)制的介紹進(jìn)一步對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行探討。

植物激素；體細(xì)胞胚發(fā)生；調(diào)控；發(fā)生機(jī)制

1 前言

一般情況下可以將植物體細(xì)胞發(fā)生（Somatic Embryogenesis）理解為在對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，不和性細(xì)胞進(jìn)行融合，利用與受精卵相似的方式構(gòu)成新個(gè)體形體的演變過程，通過細(xì)胞胚產(chǎn)生的胚胎結(jié)構(gòu)，可以將其稱為胚狀體或者體細(xì)胞胚（本文下面簡稱體胚）。從20世紀(jì)50、60年代開始，Steward、Reinert等研究學(xué)者分別從胡蘿卜懸浮細(xì)胞系、固體培養(yǎng)的胡蘿卜愈傷組織中獲取體胚后，相關(guān)學(xué)者在就在該新領(lǐng)域展開了大量研究并取得顯著的成果。體胚發(fā)生的研究進(jìn)展迅速，在2000年前就果樹方面而言，已有28科43屬93種雜種的果樹在離體條件下形成了體胚。

2 植物激素調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生

近年來對(duì)激素調(diào)控體胚發(fā)生的研究進(jìn)展迅速，但這種調(diào)控十分復(fù)雜，比如多種植物激素發(fā)生的生理作用具備一定的專一性，但是其各異的生理效應(yīng)是由于不同類型激素間的相互作用產(chǎn)生的。同一激素能對(duì)多個(gè)發(fā)育的進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控，并且其同種特性的發(fā)育過程中需要由多種不同的激素相互協(xié)作，同時(shí)各種激素對(duì)不同植物及同一植物不同階段的體胚發(fā)生作用各異。合理使用相應(yīng)激素對(duì)體胚發(fā)生起重要調(diào)控作用。

2.1 生長素與細(xì)胞分裂素對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控

自1928年荷蘭F.W.溫特從燕麥胚芽鞘尖端分離出一種具生理活性的物質(zhì)稱為生長素以來，隨著研究的進(jìn)展，生長素被廣泛用于相關(guān)研究中，本章節(jié)將就此對(duì)生長素和細(xì)胞分裂素給體胚開展調(diào)控進(jìn)行綜述。通常情況下會(huì)認(rèn)為,生長素是誘導(dǎo)體胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。常用的生長素有IAA，NAA和2,4-D。其中2,4-D在胚性愈傷組織的誘導(dǎo)中起著重要作用，對(duì)多種類型植物組織進(jìn)行脫分化培養(yǎng)過程中必須使用2,4-D進(jìn)行調(diào)控，其中尤以需要較高濃度的2,4-D單子葉植物最為突出。細(xì)胞分裂素主要是通過促進(jìn)細(xì)胞分裂而促進(jìn)體胚生長，最常用的細(xì)胞分裂素有KT和6-BA。Gaj對(duì)不同物種利用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的基本情況進(jìn)行了分析和統(tǒng)計(jì)，并研究情況指出其中有80%的植物能夠通過生長素單獨(dú)誘導(dǎo)或與細(xì)胞分裂素相結(jié)合的方式進(jìn)行體胚的誘導(dǎo)；同時(shí)明確提出在多數(shù)的研究中會(huì)使用2,4-D。另外在多項(xiàng)對(duì)植物體細(xì)胞胚發(fā)生研究的過程中都會(huì)利用生長素和細(xì)胞分裂素相結(jié)合的方式，使其誘導(dǎo)體胚得以順利進(jìn)行。

多數(shù)植物的體細(xì)胞胚發(fā)生都需要通過生長素和細(xì)胞分裂素結(jié)合的方實(shí)現(xiàn)。只添加生長素能讓胡蘿卜體細(xì)胞胚被誘導(dǎo)，而再次添加濃度較低的玉米素則能使其發(fā)生率被大幅度提升并實(shí)現(xiàn)同步化。例如2,4-D和KT的比例不同時(shí)，都會(huì)對(duì)植株再生途徑產(chǎn)生影響，當(dāng)培養(yǎng)基中為0.1mg/L2,4-D時(shí)該結(jié)果更傾向于體細(xì)胞胚的發(fā)生,當(dāng)為0.2mg/LKT和0.1mg/L2,4-D時(shí)則會(huì)利于器官發(fā)生。在DKW的培養(yǎng)基中附加6-BA1.1mg/L和KT2.0mg/L以及IBA0.01mg/L時(shí)，對(duì)于核桃愈傷組織的誘導(dǎo)有著顯著效果,而當(dāng)其培養(yǎng)基中只含細(xì)胞分裂素時(shí),使核桃體細(xì)胞胚的發(fā)生容易被誘導(dǎo)。相關(guān)研究學(xué)者根據(jù)其特性配置了15種不同配比的激素組合，并對(duì)利用2,4-D和BA等對(duì)百合鱗片葉器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行研究,最終試驗(yàn)結(jié)果顯示:利用MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，BA主要是對(duì)植體直接分化不定芽進(jìn)行誘導(dǎo)；而2,4-D則對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生直接進(jìn)行誘導(dǎo),當(dāng)2,4-D濃度為4.0mg/L時(shí)，其體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)效果最好；而當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在BA和2,4-D時(shí),兩種現(xiàn)象都會(huì)出現(xiàn)。

2.2 脫落酸ABA對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控

在進(jìn)行植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過程中脫落酸有著重要的作用，也是其中的重要激素。據(jù)研究結(jié)果顯示，使體細(xì)胞胚得以成熟關(guān)鍵因素是ABA，其作用在于能讓細(xì)胞胚快速成熟，避免出現(xiàn)裂生多胚的情況，進(jìn)而造成畸形胚。早在1974年,Ammirat就關(guān)于ABA能促使葛縷子（CarumcarviL.）體細(xì)胞胚胎快速發(fā)育進(jìn)行了報(bào)道。而Kamada等研究人員在進(jìn)行胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)其ABA含量一直處于偏低的狀態(tài),但是由非胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞和從胚性細(xì)胞團(tuán)發(fā)育形成有形態(tài)結(jié)構(gòu)的球形胚兩個(gè)質(zhì)變發(fā)生階段中,ABA的含量均有所增加。根據(jù)唐巍等研究人員的實(shí)驗(yàn)顯示：在對(duì)針葉林木體胚發(fā)生進(jìn)行研究中ABA有著重要影響，因此在進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)中添加ABA能使體胚發(fā)育成熟率加快。過去ABA主要是用于加快野蒿（Artemisia campestrisL.）和大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）的體細(xì)胞胚成熟中。而近年來 Fowke和Attree研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使白云杉（Picea glauce（Moeach）Voss.） 未成熟體細(xì)胞胚放置在 ABA （16～22μmol·L-1）和PEG4000（7.5%）的組合物中一段時(shí)間后，不僅能有效的抑制早熟萌發(fā)，對(duì)于成熟頻率的提升和形成較高質(zhì)量的胚有著重要影響。并且該結(jié)論和廖宇賡進(jìn)行臺(tái)灣云杉（Picea morrisonicola Hayata）試驗(yàn)的結(jié)果相似。此外相關(guān)研究顯示，在對(duì)防風(fēng)體細(xì)胞胚進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，添加,附加0.5-1.0mol/LABA，能讓次生胚的形成被成功移植，同時(shí)避免了畸形胚狀體的發(fā)生。陳金慧等在雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎研究中指出ABA的使用能有效控制畸形胚的產(chǎn)生。研究表明，不管是外源ABA與內(nèi)源ABA都能使體細(xì)胞胚發(fā)生實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用，通過添加4.0μmol/L外源ABA的方式使體細(xì)胞胚發(fā)生頻率與質(zhì)量明顯提升。

根據(jù)Dennis等的實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)在含有200mmol/L蔗糖的培養(yǎng)基中添加2mol/LABA時(shí)，能讓其體細(xì)胞胚的數(shù)量得到有效的提升，和王清連等研究結(jié)果具有一致性。但是在魏岳榮等研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)在香蕉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)初期時(shí)添加一定濃度ABA時(shí)，會(huì)使體細(xì)胞胚的發(fā)生受到移植,嚴(yán)重者讓其在萌發(fā)時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的愈傷化。此項(xiàng)研究差異還需進(jìn)一步進(jìn)行說明。

2.3 赤霉素對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控

赤霉素在植物組織培養(yǎng)中研究較多的是具有生理活性的GA1、GA3。其突出的作用是加速細(xì)胞的伸長，提高植物體內(nèi)生長素的含量，對(duì)細(xì)胞的分裂有促進(jìn)作用，并促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)大。由于很多植物在無赤霉素的情況下都能生成體胚，可能其內(nèi)源GAs能夠滿足體胚發(fā)生需要。因此，關(guān)于赤霉素（GAs）調(diào)節(jié)體胚發(fā)生和發(fā)育的報(bào)道較少。

吳蝴蝶等研究指出GA3在橡膠體細(xì)胞胚萌發(fā)成苗中起重要作用，其用量在0.5～1mg/L較合適,不宜超過2mg/L。根據(jù)張寶紅等研究證實(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基中GA3含量較高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)陸地棉畸形胚的情況發(fā)生，這對(duì)于植物體細(xì)胞胚發(fā)生來說是極為不利的。而赤霉素在對(duì)蘋果、梨、紅醋栗、櫻桃等果樹的體胚發(fā)生中有著積極作用同時(shí),在柑橘中則會(huì)出現(xiàn)利弊并存的現(xiàn)象。

2.4 乙烯對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控

在植物體能廣泛分布且能起到調(diào)節(jié)作用的是乙烯和多胺等物質(zhì)。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程中的組織培養(yǎng)時(shí)處于密封或半密封的容器中，這就使得乙烯的積累不能被避免，并且對(duì)于體胚發(fā)生和發(fā)育有著一定的影響。乙烯雖然對(duì)胡蘿卜愈傷組織中的體胚發(fā)生有著抑制作用，但是該物質(zhì)產(chǎn)生的抑制劑，例如Co2+、Ni2+等能讓乙烯的產(chǎn)生被抑制的同時(shí)使胡蘿卜體胚發(fā)生率被提升。多胺對(duì)于DNA負(fù)電荷有著中和效果,并且能使其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,其DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度跟體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)的情況有著一定的聯(lián)系。多胺對(duì)于體胚發(fā)生的促進(jìn)和制止乙烯合成有著一定的聯(lián)系。當(dāng)將乙烯和多胺生物進(jìn)行融合時(shí)能有效的對(duì)體胚的發(fā)生和發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。有些研究表明乙烯對(duì)體胚的發(fā)生有著利弊影響,同時(shí)也有相關(guān)研究顯示當(dāng)植物的品種或材料的胚性強(qiáng)弱不同時(shí)，其影響也就不同,并且還有研究顯示,乙烯不會(huì)對(duì)體胚的發(fā)生造成顯著的影響。黃學(xué)林等研究得出：乙烯抑制體細(xì)胞胚發(fā)生,但能促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。當(dāng)體細(xì)胞胚的種類和發(fā)育階段存在一定的差異時(shí)，其培養(yǎng)容器中累積的乙烯產(chǎn)生的利弊效果也會(huì)不同。造成這些結(jié)果存在差異性的原因和物種以及處理方式差別有著一定的聯(lián)系，同時(shí)乙烯的量也有著一定的影響，該物質(zhì)的具體作用機(jī)理還需要由相關(guān)人員進(jìn)一步研究分析。

3 激素調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)制

在植物體細(xì)胞的發(fā)生過程中植物激素不是直接作為生長素而存在的，而是需要利用內(nèi)源激素含量變化發(fā)揮作用。相關(guān)研究有結(jié)果顯示：2,4-D主要是利用細(xì)胞內(nèi)源IAA代謝而發(fā)生的，其內(nèi)源性IAA含量的上升或維持在較高的水平是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個(gè)共同標(biāo)志。據(jù)相關(guān)的學(xué)者研究顯示，將胡蘿卜組織置于培養(yǎng)中，外源2,4-D有利于內(nèi)源IAA大量積累，胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的能力與內(nèi)源IAA水平的升高密切相關(guān)。一些激素通過影響DNA甲基化程度，由于甲基化能夠影響基因的失活和表達(dá)，從而影響體胚的發(fā)生。理想狀態(tài)下的DNA甲基化水平有利于正常的體胚發(fā)育,但是當(dāng)DNA甲基化程度過高或過低使都會(huì)迅速對(duì)體胚發(fā)生造成抑制，Loschiavo等觀察到，2,4-D的濃度與否和細(xì)胞核DNA甲基化情況有著直接聯(lián)系，當(dāng)將胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)在含高濃度2,4-D的培養(yǎng)條件中時(shí)，其細(xì)胞核DNA甲基化也會(huì)隨之增加，而基因表達(dá)活性則會(huì)下降；當(dāng)除去或降低2,4-D濃度時(shí)，其細(xì)胞核DNA的甲基化會(huì)明顯降低，進(jìn)而使相應(yīng)的基因被激活。

就體細(xì)胞胚胎發(fā)生本質(zhì)而言主要是因?yàn)轶w細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素的影響,進(jìn)而使某些特異基因的表達(dá)被開啟,主要體現(xiàn)為胚性蛋白的產(chǎn)生。在體細(xì)胞胚形成中植物激素有著一定的有調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控。在胡蘿卜的各種基因中Dcarg-1會(huì)受到生長素調(diào)控的影響,并且只處于誘導(dǎo)前期進(jìn)行表達(dá),由此可見生長素處理能夠形成一種脅迫環(huán)境,容易造成觸發(fā)體胚的發(fā)生。在對(duì)煙草細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)過程中，利用2,4-D對(duì)生長素饑餓的細(xì)胞進(jìn)行處理，并在15～30min后，其中的mRNA開始積累，經(jīng)過cDNA文庫進(jìn)行差異性篩選后，得出7種2,4-D誘導(dǎo)的mRNA，其中有3種屬于生長素初期應(yīng)答基因，學(xué)者根據(jù)這個(gè)結(jié)果判斷編碼的蛋白可能與細(xì)胞分裂的起始有一定的聯(lián)系。目前,與胚發(fā)育密切相關(guān)的基因有（LEA）基因、體胚分泌蛋白基因、胚根發(fā)育相關(guān)基因、脂體跨膜蛋白基因、（SERK）基因、與翻譯有關(guān)的延伸因子EF21的基因等。這些基因中的大多數(shù)會(huì)因?yàn)橥庠醇に卦斐捎绊?，進(jìn)行出現(xiàn)差異的表達(dá)。LEA基因編碼中的LEA蛋白屬于在胚胎發(fā)生后期種子中占比較大的一系列蛋白質(zhì)，容易因?yàn)锳BA和脫水信號(hào)的影響，并且能在種子脫水過程中對(duì)其胚胎的保護(hù)。Kim等研究學(xué)者對(duì)苜蓿的高胚性和低胚性進(jìn)行培養(yǎng),最終結(jié)果顯示NAA也許是對(duì)MtSERK1的上游正進(jìn)行調(diào)控的物質(zhì),而BAP則是利用NAA的作用使NAA誘導(dǎo)效果被提升，2,4-D也可能參與了胡蘿卜和鴨茅培養(yǎng)時(shí)的SERK基因表達(dá)調(diào)控。

4 體細(xì)胞胚發(fā)生存在的問題及展望

目前對(duì)植物體胚發(fā)生研究雖然取得較大的進(jìn)步，并且其部分的研究成果在園藝和林業(yè)等生產(chǎn)中得到應(yīng)用。但是實(shí)際的應(yīng)用和研究過程中仍有問題存在。比如體胚轉(zhuǎn)換率的提高和體胚發(fā)生的遺傳穩(wěn)定程度的控制力度以及體胚發(fā)生的分子機(jī)理等方面的問題有待處理和探討。與此同時(shí),為了使體細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)得以體現(xiàn)，需要對(duì)其體細(xì)胞胚發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,其中尤以離體培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞分化時(shí)基因差異的表達(dá)和機(jī)理的調(diào)控等，而高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展將為其研究帶來更大的方便。

Q944.46

A

1005-7897（2016）02-00103-02

2016-1-9