劉海姣 范軼鑫 潘秀秀 姜來 劉文濤 張廣欽

·實驗研究·

原花青素對小鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎的實驗研究

劉海姣 范軼鑫 潘秀秀 姜來 劉文濤 張廣欽

目的利用小鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型,評估原花青素對于單鈉尿酸鹽(MSU)晶體誘發(fā)的關(guān)節(jié)腫脹及疼痛的治療作用。方法將MSU晶體直接注射到小鼠踝關(guān)節(jié)腔,然后利用縛線法測定小鼠踝關(guān)節(jié)周徑,Von Frey Hairs測定小鼠機械痛閾值,Western Blot檢測P38的磷酸化水平,考察原花青素對急性痛風性關(guān)節(jié)腫脹和疼痛的治療作用。結(jié)果原花青素給藥組(15、30、60 mg/kg)的機械痛閾值、踝關(guān)節(jié)周徑與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比,模型組的P38磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比,原花青素給藥組(15、30、60 mg/kg)的P38磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論原花青素可以通過抑制P38的磷酸化水平緩解急性痛風性關(guān)節(jié)腫脹和痛風痛。

原花青素；關(guān)節(jié)腫脹；痛風痛；P38

痛風主要是由嘌呤代謝異常等導致的尿酸生成增多或者尿酸排泄減少而引起的一種代謝型疾病［1］。當單鈉尿酸鹽以晶體的形式沉積在關(guān)節(jié)處時,可以誘發(fā)紅、腫、熱、痛等癥狀,給患者帶來了極大痛苦［2］。令人遺憾的是,現(xiàn)有的抗痛風藥物雖然具有一定的治療作用,但效果遠不能令人滿意,并且長期使用往往具有肝腎損傷和胃腸道反應等副作用［3］。

巨噬細胞在痛風性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要作用。尿酸鹽在關(guān)節(jié)的沉積可以招募巨噬細胞在關(guān)節(jié)處的聚集,而活化的巨噬細胞能夠釋放多種炎癥因子、趨化因子等,與此同時還能招募更多的炎癥細胞的浸潤,導致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛［4］。以往的研究發(fā)現(xiàn)MSU結(jié)晶體可以誘發(fā)氧自由基(ROS)的產(chǎn)生,而ROS在巨噬細胞活化過程中發(fā)揮了重要作用［5,6］。ROS可以激活MAPK家族信號,進而激活NF-kB信號通路,釋放白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎癥因子,放大疼痛及炎癥反應［7］。

原花青素是廣泛存于葡萄籽、藍莓的生物類黃酮,具有很強的抗氧化性即清除ROS的能力,其抗氧化性能是維生素C的20倍,維生素E的50倍。本研究擬考察原花青素對于小鼠關(guān)節(jié)腔注射MSU晶體誘發(fā)的急性痛風性關(guān)節(jié)炎的治療作用并探討其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 原花青素(南京澤朗植提技術(shù)有限公司)；尿酸鈉(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 動物 30只雄性CD-1小鼠,清潔級,體重18～22 g,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,實驗動物使用許可證號：SCXK (滬) 2013-0016。

1.3 儀器 電泳儀(美國 Bio-Rad公司)；化學發(fā)光儀(ChemiDoc XRS+,美國 Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 MSU晶體的制備 稱取尿酸鈉,加至1 mol/L的氫氧化鈉中,再加入無菌生理鹽水煮沸溶解,冷卻至室溫后,調(diào)節(jié)pH到7.2,離心吸取上清,室溫靜置2 d使MSU晶體析出,離心棄上清得MSU晶體,臨用前經(jīng)超聲并且配置出所需濃度。

1.4.2 急性痛風模型的建立以及小鼠機械痛閾值和關(guān)節(jié)腫脹度的測定 小鼠使用水合氯醛(400 mg/kg,腹腔注射) 麻醉,將MSU晶體(0.5 mg/10 μl)注射至小鼠踝關(guān)節(jié)脛附踝關(guān)節(jié)腔,對照組注射等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。采用縛線法測量小鼠踝關(guān)節(jié)周徑,使用Von Frey Hairs測痛儀測量小鼠機械痛閾值。分別測量小鼠造模前和造模后不同時間點的周徑,測量小鼠造模前和造模后不同時間點的機械痛閾值,并計算造模后周徑與造模前周徑的差值作為關(guān)節(jié)腫脹度的衡量標準。

1.4.3 原花青素對于P38磷酸化水平的影響 采用Western Blot 技術(shù)檢測P38磷酸化水平變化。具體方法如下：于關(guān)節(jié)腫脹最高的點(24 h),采用腹腔給予水合氯醛溶液麻醉小鼠,取踝關(guān)節(jié)組織,加入蛋白質(zhì)裂解液處理樣品,離心取上清進行BCA定量,加5×Loading buffer,煮沸 5min,-80℃保存。根據(jù)BCA定量上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h后加入一抗過夜,TBST洗后二抗孵育2 h,TBST洗后顯色。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 性質(zhì)穩(wěn)定的針尖樣MSU晶體 晶體4℃保存1個月后形態(tài)沒有顯著改變,依舊具有穩(wěn)定的晶體形態(tài)。圖1(左)和圖1(右)分別為剛制備和放置1個月后的MSU晶體。

圖1 MSU晶體形態(tài)

2.2 原花青素對MSU晶體誘導的關(guān)節(jié)腫脹和機械痛閾的影響 實驗動物分為5組,各6只,即對照組(注射PBS)、模型組(注射MSU晶體)、給藥組(15、30、60 mg/kg原花青素,灌胃給藥),實驗結(jié)果表明：模型組可以誘發(fā)小鼠踝關(guān)節(jié)明顯腫脹,而注射PBS組沒有顯著變化,模型組與對照組踝關(guān)節(jié)周徑比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明造模成功。在造模后24 h,模型組小鼠的踝關(guān)節(jié)周徑平均增大了3.7mm,而原花青素給藥組(15、30、60 mg/kg)的踝關(guān)節(jié)周徑的腫脹程度顯著降低,且與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2(左)。MSU晶體造模后8 h,可以誘發(fā)顯著的機械性痛覺超敏,模型組小鼠的機械學痛閾值平均由1.334 g降為0.272 g,而對照組的機械學痛閾則沒有顯著改變,提示模型成功建立。原花青素能夠緩解MSU晶體誘導的痛覺異常,且呈劑量依賴性。原花青素給藥組(15、30、60 mg/kg)的機械痛閾值與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其機械痛閾值分別為0.398 g、0.6 g、0.68 g。見圖2(右)。

2.3 原花青素對踝關(guān)節(jié)組織處P38磷酸化水平的影響 與對照組相比,模型組的P38磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,原花青素給藥組(15、30、60 mg/kg)的P38磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖2 原花青素對MSU晶體誘導的關(guān)節(jié)腫脹以及機械痛閾值的影響

圖3 原花青素對于踝關(guān)節(jié)組織處P38磷酸化水平的影響

3 討論

現(xiàn)有的痛風治療藥物主要分為三類：第一類是以別嘌呤醇為代表的抑制尿酸合成的藥物；第二類是以丙磺舒為代表的促進尿酸排泄的藥物；第三類是以非甾體類抗炎藥、秋水仙堿、類固醇類激素為代表的消炎鎮(zhèn)痛藥物。對于急性痛風性關(guān)節(jié)炎的治療,往往使用第三類,即利用消炎鎮(zhèn)痛藥物來改善癥狀。然而非甾體類抗炎藥的抗炎效果較弱,雖然可部分緩解急性痛風癥狀,但卻易引起胃腸道反應等副作用。秋水仙堿作為治療痛風的傳統(tǒng)藥物,不良反應更為常見,除胃腸道反應外甚至會引起骨髓抑制。而類固醇類激素雖然能起到消炎鎮(zhèn)痛的效果,卻不宜長期服用［3］。而本研究選擇的藥物原花青素來源廣泛且具有很高的安全性,小鼠口服原花青素的LD50>4000 mg/kg,本研究中所用的最高劑量為60 mg/kg,相當于人劑量為6.67 mg/kg,這個劑量已經(jīng)具有顯著的抗炎與鎮(zhèn)痛作用。與現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物相比,原花青素無疑具有巨大的安全優(yōu)勢。

以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)炎癥細胞尤其是巨噬細胞在急性痛風性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用。MSU晶體被巨噬細胞吞噬后,能招募更多的炎癥細胞如中性粒細胞、肥大細胞等,進而釋放釋放許多炎癥因子如IL-1β、TNF-α、前列腺素以及單核細胞趨化因子等,進而誘發(fā)了MSU沉積部位的關(guān)節(jié)腫脹或者疼痛［8］。本實驗研究顯示與模型組相比,原花青素組能顯著抑制急性痛風性關(guān)節(jié)腫脹。MSU晶體誘導的急性痛風性疼痛在造模后8 h表現(xiàn)為疼痛最嚴重,與模型組相比,原花青素組能顯著抑制機械學痛覺超敏。

MAPKs家族在急性痛風性炎癥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,其中以P38最為重要。在急性痛風性關(guān)節(jié)炎小鼠的滑液組織以及痛風患者的滑液中,P38的磷酸化水平均顯著升高［9］。MSU誘發(fā)的組織損傷或者招募的炎癥細胞釋放的炎癥因子均可以作用于P38-NF-kB信號系統(tǒng),進而誘發(fā)炎癥細胞釋放更多的炎癥因子與細胞因子,參與炎癥放大。除了炎癥反應,P38 還可以敏化瞬時型感受器電位離子通道V1 (TRPV1),對于疼痛的外周敏化極為重要。已有研究報道使用TRPV1拮抗劑能有效地減少MSU晶體誘導的疼痛和關(guān)節(jié)腫脹［10］。以往研究發(fā)現(xiàn),MSU晶體可以誘發(fā)巨噬細胞中的ROS顯著升高,ROS對于巨噬細胞中的P38激活具有非常重要的作用。而原花青素有著強大的自由基清除功能,我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制MSU誘發(fā)的關(guān)節(jié)處P38的激活,這與前半部分的研究即原花青素有效緩解MSU晶體誘導的關(guān)節(jié)腫脹和機械性痛覺超敏相一致。

綜上所述,原花青素能夠抑制MSU晶體誘導的關(guān)節(jié)腫脹及機械痛,并能顯著抑制P38的磷酸化水平。本研究為痛風的治療提供了一種潛在的安全有效的藥物,并可能為通過清除氧自由基抑制MAPK家族P38的異常升高,進而抑制炎癥因子的產(chǎn)生來改善痛風性關(guān)節(jié)炎,提供了一種新的治療策略。

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Experimental research of procyanidine for acute gouty arthritis in rats

LIU Hai-jiao,FAN Yi-χin,PAN Xiu-χiu,et al.Teaching and Research Office of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China

ObjectiveTo evaluate curative effect by procyanidine for monosodium urate (MSU) crystals -induced arthrocele and pain on the basis of acute gouty arthritis rats model.MethodsAfter injection of MSU crystals into rats ankle joint cavity,thread test was applied to measure ankle diameter,Von Frey Hairs test was used to detect pain withdrawal mechanical threshold value,and Western Blot test was applied for phosphorylation level detect in P38,in order to investigate curative effect by procyanidine for acute gouty arthrocele and pain.ResultsProcyanidine medication groups (15,30,60 mg/kg) and model group had statistically significant difference of pain withdrawal mechanical threshold value and ankle diameter (P<0.05).Comparing with control group,model group had obviously higher P38 phosphorylation level (P<0.05).In comparison with model group,procyanidine medication groups (15,30,60 mg/kg) had much lower P38 phosphorylation level (P<0.05).ConclusionProcyanidine can relieve acute gouty arthrocele and gout pain by inhibiting P38 phosphorylation level.

Procyanidine; Arthrocele; Gout pain; P38

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.22.127

2016-10-31］

國家自然科學基金資助項目 (項目編號：81471142)

211198 中國藥科大學/臨床藥學教研室(劉海姣范軼鑫 張廣欽)；南京醫(yī)科大學/江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點實驗室(潘秀秀 姜來 劉文濤)

張廣欽