王 斌 潘戰(zhàn)宇 閆祝辰 劉東穎 蘭 嵐 王 琮 姜戰(zhàn)勝

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，天津 300060)

論 著

姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721增殖及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響及機(jī)制※

王 斌 潘戰(zhàn)宇 閆祝辰 劉東穎 蘭 嵐 王 琮 姜戰(zhàn)勝

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，天津 300060)

目的 觀察姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721增殖及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。方法 實驗分為對照組、姜黃素組、AG490組、姜黃素+AG490組，其分別作用于人肝癌細(xì)胞SMCC-7721后，通過噻唑藍(lán)(MTT)法分別檢測其對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721生長的抑制作用；通過Western blot法、RT-PCR法分別檢測各組人肝癌細(xì)胞SMCC-7721中轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、p-STAT3、CD24、CD133、CD44和CD90蛋白的表達(dá)及mRNA的變化。結(jié)果 姜黃素可明顯抑制人肝癌細(xì)胞SMCC-7721的增殖，同時下調(diào)STAT3、p-STAT3、CD24、CD133、CD44和CD90蛋白表達(dá)；其作用強(qiáng)度較AG490稍弱，但兩藥合用顯示出一定的協(xié)同效果。結(jié)論 姜黃素抑制人肝癌細(xì)胞SMCC-7721的增殖，降低人肝癌細(xì)胞SMCC-7721中CD24、CD133、CD44和CD90表達(dá)，其機(jī)制可能與調(diào)控STAT3磷酸化相關(guān)。

姜黃素；肝腫瘤；基因表達(dá);細(xì)胞凋亡;中藥療法

姜黃素是從姜科、天南星科中一些植物根莖中提取的一種化學(xué)成分，近年來已成為腫瘤預(yù)防和治療的一個研究熱點[1-2]，在腫瘤干預(yù)及治療領(lǐng)域有較多報道。然而，目前關(guān)于姜黃素抗肝癌治療作用的機(jī)制方面尚無明確定論，近年來，姜黃素對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)活性的調(diào)控作用越來越受人們重視，姜黃素抑制肝癌細(xì)胞的機(jī)制是否也是通過抑制兩面神激酶(Janus Kinase)JAK-STAT信號通路STAT3磷酸化(p-STAT3)途徑完成的，目前尚缺乏證據(jù)及相關(guān)研究。本研究通過姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞SMCC-7721，從基因水平及蛋白水平探討姜黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，并進(jìn)一步觀察姜黃素通過調(diào)控STAT3磷酸化是否可干預(yù)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，為姜黃素治療肝癌進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 姜黃素(中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200815)，JAK2激酶抑制劑AG490(美國Calbiochem公司)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(31800022，美國，GIBCO公司)，Trizol RNA提取試劑(15596018，美國，invitrigen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，K1622)，SYBGREE實時定量PCR試劑盒(DRR096A，Takara公司)，Bradford蛋白測定試劑盒(WB2001，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，STAT3、p-STAT3、CD24、CD133、CD44、CD90抗體(Abcam公司)；超凈工作臺(BSC-1000IIB2，中國，蘇州安泰空氣有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(BB15，美國，Heraeus公司)，TS100熒光倒置顯微鏡(TS100，日本，Nikon公司)，低溫高速離心機(jī)(ALLEGRA X-12，美國，Beckman公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳槽(DYCP-31C，中國，北京市六一儀器廠)，凝膠成像儀(1600R，中國，上海天能公司)，流式細(xì)胞儀(C6，美國，BD公司)，熒光定量PCR儀(ABI7500，美國ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素，置37.0 ℃、飽和濕度、5%CO2恒溫密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)傳代，平均3～4 d傳代1次。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院實驗室保存。

1.3 藥物稀釋及實驗分組 姜黃素用二甲基亞砜(DMSO)助溶，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成60 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?。AG490溶液配置：1.47 mg AG490溶于100 mL 1640培養(yǎng)液中，使其終濃度為50 μmol/L，-20 ℃避光保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。本研究共分為4組：①對照組(只加培養(yǎng)基)；②AG490組(50 μmol/L)；③姜黃素組(60 μmol/L)；④姜黃素+AG4910組(60 μmol/L姜黃素+50 μmol/L AG490)。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測姜黃素對人肝癌細(xì)胞株SMCC-7721增殖的影響 接種對數(shù)生長期SMCC-7721細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，加入各組藥物，每個濃度設(shè)5個平行復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，傾去MTT溶液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處的吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞抑制曲線，計算SMCC-7721細(xì)胞各組增殖抑制率。

1.5 RT-PCR法檢測相關(guān)基因mRNA變化 各組藥物作用SMCC-7721細(xì)胞24 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以Trizol試劑盒提取實驗組與對照組細(xì)胞總RNA，從中取1 μL溶于99 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，通過紫外分光光度計測定260 nm和280 nm光密度值，計算RNA的純度。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)。

引物根據(jù)文獻(xiàn)[3-7]獲得，由上海生工合成，序列如下：

STAT3上游引物:5'-GGAGGAGGCATTCGGAAAG-3',下游引物:5'-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3';CD24上游引物:5'-CCAGGGGCAATGATGAATGAGA-3',下游引物:5'-GGGAGGCTGAGGCAGGAGAAT-3';CD133上游引物:5'-CACTCTATACCAAAGCGCAA-3',下游引物:5'-CACGATGCCACTTTCTCAC-3';CD44上游引物:5'-ACCCCATCCCAGACGAAGACAGTC-3',下游引物:5'-GGGATGAAGGTCCTGCTTTCCTTCG-3';CD90上游引物:5'-CGCCATGAGAATACCGCAG-3',下游引物:5'-CCCTCGTCCTTGCTAGTGA-3';GAPDH上游引物:5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3',下游引物:5'-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3'。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化 各組藥物作用SMCC-7721細(xì)胞24 h，與對照組細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液清洗3次，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰浴裂解30 min，移至EP管，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清液，Bradford法測定蛋白濃度。按常規(guī)方法灌制10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，實驗樣本每道點樣20 μL，80伏電壓下電泳2 h后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBST)室溫封閉2 h后，加入含2%脫脂奶粉的PBST稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜6次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫孵育45 min，TBST洗膜6次后與電化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑顯色2 min，曝光X膠片。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素抑制人肝癌細(xì)胞SMCC-7721增殖 MTT法檢測結(jié)果顯示，人肝癌細(xì)胞SMCC-7721經(jīng)不同分組的藥物作用后，姜黃素顯示了一定的抑制增殖作用，不同分組抑制作用表現(xiàn)為姜黃素組

圖1 各組不同藥物濃度細(xì)胞抑制率情況

2.2 姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721相關(guān)基因mRNA水平的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，如“1.3”中分組STAT3 mRNA表達(dá)分別是對照組的29.4%、60.2%和18.3%；CD24 mRNA表達(dá)分別是對照組的21.7%、35.0%和12.0%；CD133 mRNA表達(dá)分別是對照組的30.8%、40.9%和18.8%；CD44 mRNA表達(dá)分別是對照組的25.1%、68.4%和12.8%；CD90 mRNA表達(dá)分別是對照組的47.9%、61.0%和18.9%(見圖2)。

2.3 姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721相關(guān)蛋白的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各分組的藥物作用人肝癌細(xì)胞SMCC-7721 24 h后，STAT3、p-STAT3、CD24、CD133、CD44和CD90表達(dá)均顯著減少，說明姜黃素能下調(diào)肝癌細(xì)胞SMCC-7721細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)，且與陽性對照藥AG490有協(xié)同作用(見圖3)。

圖2 姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

圖3 姜黃素對人肝癌細(xì)胞SMCC-7721相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus Kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信號通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，STAT3作為STAT家族成員之一，是JAK-STAT信號通路中重要信號因子，磷酸化的STAT3(p-STAT3)是其激活后的形式。正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中STAT3蛋白的激活快速而短暫，異常激活的JAK-STAT信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在許多腫瘤的形成過程中發(fā)現(xiàn)有STAT3持續(xù)激活[8-10]。其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注，是多種人類腫瘤干預(yù)治療有效的分子標(biāo)靶之一[11]。近年來，JAK-STAT信號通路與肝癌的關(guān)系越來越受人們重視。

腫瘤干細(xì)胞是近幾年提出的關(guān)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的新理論，該理論認(rèn)為導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和維持腫瘤生長的是一小群叫做腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞，這些細(xì)胞在腫瘤組織中數(shù)量極少，具有自我更新、分化及抗治療能力等干細(xì)胞特性，影響著腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，只有消滅這些細(xì)胞才能根治腫瘤。

《Cell stem cell》在2011年7月發(fā)表了香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院的一項新的研究成果[12]。在研究中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)及產(chǎn)生化療抗藥性的元兇是一種癌干細(xì)胞，只要抑制該干細(xì)胞傳遞消息的蛋白物，就可提升治療肝癌的效果。并利用基因表達(dá)譜芯片找出了癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD24+。進(jìn)一步的研究中還突破性地拆解了CD24+標(biāo)志的癌干細(xì)胞啟動腫瘤發(fā)展和自我更新的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，CD24+標(biāo)志的癌干細(xì)胞是通過激活STAT3信號來維持肝癌干細(xì)胞自我更新，促使腫瘤形成。研究結(jié)果表明，STAT3磷酸化在CD24+信號傳遞中起關(guān)鍵性作用。研究人員相信通過抑制STAT3磷酸化可控制腫瘤生長，大大提升完全消減肝癌的機(jī)會。

張斌等[13]選取196例肝細(xì)胞性肝癌組織標(biāo)本，以正常肝臟組織標(biāo)本20例作為對照，應(yīng)用免疫組化方法(SABC法)檢測JAK1蛋白和STAT3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞性肝癌組織中JAK1蛋白和STAT3蛋白的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，并表明JAK1蛋白和STAT3蛋白均為影響肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的獨立危險因素。茍澤鵬等[14]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中STAT3主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而p-STAT3主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)；STAT3和p-STAT3在肝癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，其表達(dá)與衛(wèi)星灶、血管浸潤及AJCC分期有關(guān)，可能參與了肝癌的浸潤轉(zhuǎn)移。Liu Y等[15]通過激活肝癌中白細(xì)胞介素-6(IL-6)，而使STAT3信號活化，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。而通過使用STAT3小分子抑制劑LLL12可以阻斷IL-6誘導(dǎo)STAT3的磷酸化，IL-6抗凋亡作用減弱，抑制肝癌細(xì)胞的生長。張麗杰等[16]通過實驗首次證明，人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721存在STAT3蛋白的高表達(dá)及p-STAT3的高表達(dá)，提示STAT3的異常表達(dá)和活化可能與人肝癌的發(fā)生有關(guān)。提示抑制腫瘤細(xì)胞持續(xù)活化的STAT3信號通路將為腫瘤治療及腫瘤藥物篩選提供新的思路。

姜黃素，分子式為C21H20O6，分子量為368.37。其已成為腫瘤預(yù)防和治療的一個研究熱點[1-2]，在肝癌領(lǐng)域也有很多報道，研究顯示姜黃素可明顯抑制小鼠腹水型肝癌和人肝癌細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性[17]。厲紅元等[18]發(fā)現(xiàn)姜黃素可干擾肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，具有細(xì)胞毒、抗增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。并且江敏華等[19]發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

然而，目前關(guān)于姜黃素抗肝癌治療作用的機(jī)制尚無明確定論，近幾年姜黃素對STAT3活性的調(diào)控作用越來越受人們重視，楊芳等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)姜黃素作用于人胰腺癌細(xì)胞系SW1990后，細(xì)胞增殖水平明顯下降，姜黃素呈時間、劑量依賴型方式抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。姜黃素對STAT3的蛋白表達(dá)水平無明顯影響，而對p-STAT3蛋白表達(dá)水平的抑制作用呈現(xiàn)為劑量依賴型，并抑制SW1990細(xì)胞內(nèi)STAT3靶基因Bcl-2、Bak以及Survivin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，而使Bax mRNA的表達(dá)上調(diào)。提出姜黃素的抗腫瘤作用可能與姜黃素抑制STAT3信號分子的活化，并進(jìn)一步抑制其下游靶基因的表達(dá)有關(guān)。王曉飛等[21]也提出姜黃素可以通過抑制STAT3的活化(即p-STAT3)，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2的蛋白表達(dá)水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲遷移性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可直接抑制人肝癌細(xì)胞SMCC-7721的增殖，并降低STAT3、p-STAT3、CD24、CD133、CD44和CD90的蛋白表達(dá)水平，可初步推測姜黃素是通過調(diào)控STAT3磷酸化來干預(yù)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而起到抑制肝癌細(xì)胞的作用，為姜黃素臨床應(yīng)用于治療肝癌提供了理論及實驗基礎(chǔ)，但其深入的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of curcumin on human hepatocellular carcinoma SMCC-7721 cells proliferation and stem cell markers expression and its mechanism

WANGBin*,PANZhanyu,YANZhuchen,etal.

DepartmentofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060

Objective To observe the effects of curcumin on the human hepatocellular carcinoma SMCC-7721 cells proliferation and stem cell markers expression and to investigate its related mechanism. Methods The experiment includes blank group, curcumin group, JAK2 kinase inhibitor AG490 group and curcumin+AG490 group. The human hepatocellular carcinoma SMCC-7721 cells in each group received corresponding intervention. Colorimetric MTT assay was used to assess the inhibitory effect of curcumin, AG490, and their combination on the proliferation of human hepatocellular carcinoma SMCC-7721 cells. The expressions the protein and mRNA of STAT3, p-STAT3, CD24, CD133, CD44 and CD90 were measured by real time RT-PCR and western blot in human hepatocellular carcinoma SMCC-7721 cells. Results Curcumin inhibited the proliferation of SMCC-7721 cells and down-regulated the protein expression of STAT3, p-STAT3, CD24, CD133, CD44 and CD90. Its action was slightly weaker than AG490, but their combination showed a synergistic effect. Conclusion Curcumin inhibits the proliferation of SMCC-7721 cells, which involves curcumin-induced decline in the expression of CD24, CD133, CD44 and CD99 by repressing STAT3 phosphorylation.

Curcumin; Liver tumor; Genetic expression; Apoptosis; Chinese medicine therapy

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.12.005

※ 項目來源：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院科研項目基金(編號：1320)

王斌(1983—)，男，主治醫(yī)師，碩士。從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科基礎(chǔ)及臨床研究。

R282.71;R735.7;R735.705.31;R979.5

A

1002-2619(2016)12-1778-06

2016-11-07)