紀(jì)妍，朱津，盧燕

(惠州市中心人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東惠州516001)

QF-PCR快速產(chǎn)前診斷常見非整倍體病的價(jià)值

紀(jì)妍，朱津，盧燕

(惠州市中心人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東惠州516001)

目的評價(jià)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(OF-PCR)技術(shù)在產(chǎn)前快速診斷常見染色體非整倍體病的臨床價(jià)值。方法選取2013年1月至2014年6月在我院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦1 035例，所有孕婦均接受染色體核型分析及QF-PCR檢查，比較并分析兩種檢驗(yàn)結(jié)果的符合性。結(jié)果染色體核型分析正常的孕婦1 008例中有4例QF-PCR懷疑異常，其中3例經(jīng)增加短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點(diǎn)再次分析，結(jié)果正常，1例隨訪未見異常。18例21、18、13、X、Y染色體非整倍體兩者結(jié)果一致(包括1例18三體嵌合體及1例易位型21-三體)，符合率為100%。結(jié)論QF-PCR能快速高效的檢出染色體非整倍體，但仍有誤診可能，選擇適宜的STR組合可以提高檢測效率，QF-PCR作為染色體核型分析的有效補(bǔ)充在快速產(chǎn)前診斷中有重要價(jià)值。

熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；非整倍體；產(chǎn)前診斷；短串聯(lián)重復(fù)序列

隨著優(yōu)生優(yōu)育知識(shí)的宣傳普及，孕婦對產(chǎn)前診斷的接受度逐漸提高，而產(chǎn)前診斷染色體異常的傳統(tǒng)方法為核型分析，分析結(jié)果報(bào)告時(shí)間一般在2～4周，孕婦及其家庭在等待結(jié)果過程中壓力巨大[1]，因此如能采取快速價(jià)廉而相對準(zhǔn)確的技術(shù)獲取早期初步結(jié)果很有必要。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)可利用間期細(xì)胞進(jìn)行分析，克服了核型分析周期長的缺點(diǎn)，但技術(shù)復(fù)雜，操作步驟繁瑣，試劑昂貴，因此不適合臨床大規(guī)模開展[2]。而熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR)技術(shù)利用熒光引物對染色體上特異的STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過儀器對熒光變量的檢測實(shí)現(xiàn)對染色體數(shù)目的判斷。該檢測具有出結(jié)果快，準(zhǔn)確性高，檢測批量大，試劑成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，對產(chǎn)前診斷中常見且后果嚴(yán)重的染色體非整倍體病變有較好的預(yù)判價(jià)值。本文回顧性分析我院產(chǎn)前診斷中心近年來同時(shí)接受染色體核型分析及QF-PCR兩種方法進(jìn)行羊水或臍血產(chǎn)前診斷染色體病的孕婦1 035例，分析兩種報(bào)告的發(fā)放時(shí)間及結(jié)果的符合性，探討QF-PCR對染色體非整倍體病的產(chǎn)前診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2013年1月至2014年6月在我院產(chǎn)前診斷中心接受產(chǎn)前診斷并正常報(bào)告結(jié)果(同時(shí)行染色體核型分析及QF-PCR檢測)的孕婦1 035例，標(biāo)本類型為羊水或臍血。

1.2 方法

1.2.1 羊水臍血細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析采用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，獲得足量分裂細(xì)胞，然后加入秋水仙素使分裂的細(xì)胞處于分裂中期，染色后，置于顯微鏡下觀察進(jìn)行核型分析。

1.2.2 羊水及臍血QF-PCR取1～2 ml羊水或1 ml臍血采用TaKaRa公司的基因組提取試劑盒提取DNA，所提取的DNA均采用紫外分光光度儀測OD280及OD260值以確保適宜的濃度和純度。采用達(dá)安基因公司檢測試劑盒：21-三體/性染色體多倍體檢測試劑盒及18-三體/13-三體多倍體檢測試劑盒。檢測所用STR位點(diǎn)、位置等詳見表1，部分標(biāo)本懷疑母血污染，抽取母血檢測其DNA中STR位點(diǎn)，加以排除。按照試劑盒條件對每個(gè)標(biāo)本分A(21及X/Y染色體)B (18/13染色體)兩個(gè)體系進(jìn)行擴(kuò)增；甲酰胺9.0 μl與內(nèi)標(biāo)GeneScan Rox-500 size standard(ABI)0.3 μl混合，加入A擴(kuò)增體系PCR產(chǎn)物1.0 μl或B擴(kuò)增體系PCR產(chǎn)物1.5 μl，混勻，借助于ABI3100測序儀進(jìn)行基因片段掃描分析，PCR產(chǎn)物1 μl與離子酰胺13.5 μl，Genescan-500 0.5 μl混合，95℃變性5 min，后冰浴，將產(chǎn)物放置于ABI3100遺傳分析儀進(jìn)行電泳。CENESCAN基因分型軟件掃描分析凝膠上擴(kuò)增產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)的位置，確定產(chǎn)物片段的大小。對懷疑母血污染的標(biāo)本同時(shí)采集母體標(biāo)本行QF-PCR進(jìn)行對照，避免母血污染對結(jié)果的錯(cuò)誤評判。

1.2.3 QF-PCR非整倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國際公認(rèn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)(ACC/CMGS)，正常雙峰面積比值(高峰面積/低峰面積)區(qū)間：0.8～1.4，凡雙峰面積比值＞1.8或者＜0.65時(shí)可判斷為三體，一個(gè)樣本出現(xiàn)兩個(gè)有意義位點(diǎn)方可明確診斷[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0分析軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測結(jié)果比較1 035例標(biāo)本中包含臍血15例，羊水1 020例。染色體核型分析顯示正常1 008例，其中1 004例QF-PCR也顯示正常，另有4例QF-PCR分別顯示21單體、不排除部分單體及不排除為X單體、三體或二倍體；染色體核型分析檢出10例21-三體(包括1例異位型)，3例18三體(包括一例嵌合體)，5例性染色體數(shù)目異常，QF-PCR均檢出，無漏診；此外研究對象中染色體核型分析還發(fā)現(xiàn)有9例染色體結(jié)構(gòu)異常，QF-PCR未能檢出。兩檢測技術(shù)結(jié)果比較見表2。

表2 染色體核型與QF-PCR檢測結(jié)果分析

2.221 號(hào)染色體上3個(gè)STR位點(diǎn)檢測率分析染色體核型分析顯示有21-三體10例(包括1例異位型)，QF-PCR均檢出，無漏診。其余1 025例中一例QF-PCR提示為21單體，但染色體核型顯示正常，將標(biāo)本送外院增加21號(hào)STR位點(diǎn)再次檢測，顯示為正常。還有一例兩次檢測均示D21S1411未顯示，不能排除部分單體，染色體核型及彩超未見異常。孕婦拒絕進(jìn)一步檢查，胎兒娩出后隨訪半年未見異常。QF-PCR 21號(hào)染色體上的特異性STR位點(diǎn)，結(jié)果與染色體核型的吻合情況見表3。

表321 號(hào)染色體上3個(gè)STR位點(diǎn)檢測率分析[例(%)]

2.318 號(hào)染色體上4個(gè)STR位點(diǎn)檢測率分析染色體核型分析檢出3例18-三體[包括一例嵌合體47XY，+18(45/50)；46XY(5/50)]，QF-PCR均檢出，無漏診。其余1 032例在18號(hào)染色體上QF-PCR結(jié)果與染色體核型分析完全相符。3例18-三體STR位點(diǎn)顯示情況見表4。

2.413 號(hào)染色體及性染色體STR位點(diǎn)檢測情況此次檢查未發(fā)現(xiàn)有13三體及單體，1 035例樣本中染色體分析發(fā)現(xiàn)有3例45，XO；1例47，XXY及1例47，XYY；QF-PCR結(jié)果均與之相符。有2例染色體核型未見異常，QF-PCR提示不排除為X單體、三體或二倍體，后增加X染色體位點(diǎn)DXS6809再次檢測，證實(shí)為二倍體。

表43 例18-三體STR位點(diǎn)情況分析

3 討論

眾所周知，21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體數(shù)目異常是最常見的染色體非整倍體病變[4]，這類患者往往有智力低下或生育功能受損，因此早期診斷、及時(shí)干預(yù)以避免該類患兒出生對提高人口質(zhì)量，改善家庭生活水平意義重大。

隨著唐氏篩查的普及，高齡孕婦的增加，群眾對于產(chǎn)前診斷認(rèn)知度的提高，越來越多的孕婦愿意接受產(chǎn)前診斷。但是常規(guī)染色體核型分析存在著耗時(shí)長、工作量大、易污染、失敗率高等缺點(diǎn)。因此選用適宜的方法作為替代或補(bǔ)充是有必要的[5]。目前已成功應(yīng)用于臨床的快速產(chǎn)前診斷手段有FISH、QF-PCR、多重連接探針擴(kuò)增、比較基因組雜交、新一代測序技術(shù)等。與FISH及其他快速檢測方法相比，QF-PCR具有操作簡單，無需培養(yǎng)，可大樣本上機(jī)操作，價(jià)格低廉等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。國外大樣本的研究也證實(shí)，選用多個(gè)特異性高的STR位點(diǎn)進(jìn)行QF-PCR檢測與常規(guī)染色體核型分析技術(shù)吻合度高，可顯著降低進(jìn)行產(chǎn)前診斷染色體核型分析的必要性[6]。因此我院采用QF-PCR作為快速診斷法。

我院所選STR位點(diǎn)借鑒國外權(quán)威文獻(xiàn)及其他上級醫(yī)院的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[7]，雜合度多數(shù)在0.8以上，能提供高度的遺傳信息，較好的滿足了實(shí)驗(yàn)要求。21、18、13及性染色體上分別選用3、4、4個(gè)STR位點(diǎn)，所有18例染色體非整倍體標(biāo)本全部檢出，無一例漏診，檢出率達(dá)100%。

因STR可能存在種族及地區(qū)差異，因此，選用的STR位點(diǎn)及數(shù)目不同，對非整倍體染色體病的檢出有較大差異[8]。本研究結(jié)果顯示，21-號(hào)染色體上如僅選用2個(gè)STR位點(diǎn)，對二倍體的辨別率能達(dá)到85%～90%，三倍體的檢出80%～90%，STR位點(diǎn)增加至3個(gè)，21-三體的檢出率可達(dá)到100%。18號(hào)染色體選用4個(gè)STR位點(diǎn)檢測率分析，無假陽性假陰性病例出現(xiàn)，因此認(rèn)為4個(gè)STR位點(diǎn)是適宜的。選用4個(gè)STR位點(diǎn)檢測分析，5例性染色數(shù)目異常全部檢出，無漏診。由此可見，QF-PCR檢測結(jié)果與檢測位點(diǎn)的選擇及STR位點(diǎn)的雜合度高低密切相關(guān)。

此外，染色體核型分析正常的孕婦中有4例QF-PCR懷疑異常：一例染色體核型46，XY，羊水QF-PCR在21號(hào)染色體三個(gè)STR位點(diǎn)上均顯示為單峰，父母雙方在同樣的STR位點(diǎn)上有相同的峰，因擔(dān)心出現(xiàn)單親二倍體情況，將標(biāo)本送至外院，在21號(hào)染色體上選取7個(gè)STR位點(diǎn)再次分析，原有的3個(gè)位點(diǎn)仍出現(xiàn)純合情況，另4個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰，結(jié)果顯示為二倍體。另有2例染色體核型示46，XX，但性染色體上3個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)純合現(xiàn)象，QF-PCR提示不排除為X單體、三體或二倍體。以上3例判斷有誤考慮主要與STR選擇位點(diǎn)偏少出現(xiàn)純合有關(guān)。解決辦法是盡可能選擇雜合度高，并擴(kuò)展更多的STR位點(diǎn)以達(dá)到檢測目的[9]。

還有一例兩次檢測均示D21S1411未顯示，不能排除部分單體，染色體核型及彩超未見異常，孕婦拒絕進(jìn)一步檢查，胎兒娩出后隨訪半年未見異常。因未做父母雙方相應(yīng)位點(diǎn)檢測，STR絕大多數(shù)位于非編碼區(qū)，故不能排除是否是由于無臨床意義的異染色質(zhì)變異導(dǎo)致。

實(shí)驗(yàn)選取的試劑盒在13號(hào)染色體上也選用了4個(gè)STR位點(diǎn)，但1 035例標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)有13-三體，考慮與13-三體發(fā)病率低以及絕大部分自然流產(chǎn)有關(guān)。試劑盒生產(chǎn)廠家能否設(shè)計(jì)更適應(yīng)的STR位點(diǎn)組合，在不增加反應(yīng)體系的情況下適當(dāng)減少13-三體上STR位點(diǎn)，增加21及X染色體上STR位點(diǎn)，以減少21及性染色體上出現(xiàn)純合難以分析的局面。因?yàn)榧词故锹┰\13三體，后續(xù)的產(chǎn)前超聲檢查也能檢出，但21-三體及性染色體數(shù)目異常超聲難以檢出。

此外1 035例中有9例染色體結(jié)構(gòu)異常超出QF-PCR檢測范圍未能檢出。國外文獻(xiàn)報(bào)道QF-PCR不能檢測出染色體平衡異位及異常核型＜15%三體細(xì)胞或＜20%單體細(xì)胞存在時(shí)的嵌合體[10]。雖然QF-PCR有很高的準(zhǔn)確性，但單獨(dú)使用QF-PCR進(jìn)行產(chǎn)前診斷仍值得商榷[11]，本研究中，雖然18例染色體非整倍體QF-PCR均檢出，但有4例QF-PCR提示異常標(biāo)本最后檢查正常，而且9例染色體結(jié)構(gòu)異常QF-PCR不能檢出，因此考慮中國的醫(yī)療環(huán)境，我們認(rèn)為將QF-PCR作為染色體核型分析的一種補(bǔ)充檢查，更為適宜。

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Value of quantitative fluorescent polymerase chain reaction in the rapid prenatal diagnosis of commonchromosomal aneuploidies.

JI Yan,ZHU Jin,LU Yan.Prenatal Diagnosis Center,Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the value of quantitative fluorescent-polymerase chain reaction(QF-PCR)in the prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies.MethodsA total of 1 035 pregnant women received prenatal diagnosis in our hospital from January 2013 to June 2014 were selected,which were all tested by karyotype analysis and QF-PCR.The results of the two methods were compared.ResultsAmong the 1 008 cases that were normal by karyotype analysis,4 were abnormal in QF-PCR,in which 1 was proved to be normal by follow-up and 3 were proved to be normal by short tandem report(STR)．Eighteen cases were diagnosed as abnormal involving chromosome 21,18, 13,X and Y both by karyotype analysis and QF-PCR,including 1 case of trisomy mosaicism 18 and 1 cases of translocation trisomy 21.The coincidence rate was 100%.ConclusionQF-PCR could provide rapid and effective diagnosis for chromosomal aneuploidies,but misdiagnosis may still occur.The appropriate STR combination can improve the detection efficiency.It is an efficient and reliable method for rapid prenatal diagnosis,which provides an important supplement for karyotype analysis.

Quantitative fluorescent polymerase chain reaction(QF-PCR);Aneuploidy;Prenatal diagnosis; Short tandem report(STR)

R714.15

A

1003—6350（2016）01—0056—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.020

2015-05-05)

廣東省惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2012Y020)

紀(jì)妍。E-mail：jiyanqurong@163.com