向銀洲，顧昱，彭平，許軍，寧娜

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院宜昌市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

塞來昔布聯(lián)合吡咯烷二硫氨基甲酸對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z生長(zhǎng)的影響

向銀洲，顧昱，彭平，許軍，寧娜

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院宜昌市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

目的探討塞來昔布與吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響及其可能機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不含任何藥物)、塞來昔布組(含塞來昔布50 μmol/L)、PDTC(含PDTC 50 μmol/L)組和塞來昔布+PDTC(含塞來昔布、PDTC均為25 μmol/L)組。細(xì)胞抑制率以四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)；CNE-2Z細(xì)胞周期以流式細(xì)胞儀檢測(cè)；用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)核因子(NF)-κB和環(huán)氧合酶(COX)-2蛋白的表達(dá)；用Western-blot方法檢測(cè)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表達(dá)。結(jié)果塞來昔布、PDTC單獨(dú)作用及塞來昔布+PDTC聯(lián)合作用于鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞24 h、48 h、72 h細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制(P＜0.05)，二藥聯(lián)合組與單獨(dú)用藥組比較，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。塞來昔布+PDTC聯(lián)合用藥作用于細(xì)胞48 h后G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于塞來昔布組和PDTC組，抑制效果更顯著(P＜0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示塞來昔布+PDTC組NF-κB、COX-2的表達(dá)明顯低于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。Western-blot實(shí)驗(yàn)示聯(lián)合用藥組Caspase-3蛋白表達(dá)高于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。結(jié)論Cox-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合PDTC能夠顯著抑制人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖，其機(jī)制可能是通過降低COX-2、NF-κB表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

塞來昔布；吡咯烷二硫氨基甲酸；人鼻咽癌細(xì)胞株；抑制作用

鼻咽癌是華南地區(qū)耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病原因與與多種因素相關(guān)，如遺傳易感性、病毒感染、化學(xué)致癌物等。鼻咽癌早期患者3年生存率約為90%，5年生存率徘徊在78%；晚期患者5年生存率更不樂觀，約40%，多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。因此從分子水平探索預(yù)防、治療鼻咽癌的措施很有必要，本研究探討了環(huán)氧合酶抑制劑塞來昔布聯(lián)合核因子(NF)-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料第三軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z；吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI，美國(guó)Sigma公司)；塞來昔布分析純(美國(guó)輝瑞公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，上海生物工程公司)；RPMI-1640(美國(guó)Hyclone公司)；乙二胺四乙酸(DAB)染色盒、鼠抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、鼠抗人COX-2單克隆抗體、SP-9000免疫組化盒(北京中杉金橋生物公司)；新生牛血清、胰酶(杭州四季青公司)；總RNA提取試劑Trizol(武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞，接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，加入含10%滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)更換培養(yǎng)液，進(jìn)行正常傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板上。細(xì)胞貼壁后分為塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC組(50 μmol/L)、塞來昔布(25 μmol/L)+PDTC組(25 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)。每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3板，分別在培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后除去培養(yǎng)液，每孔加入200 μl無血清培養(yǎng)液和20 μl MTT(50 mg/m1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。參照文獻(xiàn)[2]計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(0A)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/細(xì)胞對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞周期選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-2Z細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/ml，將細(xì)胞接種至100 ml培養(yǎng)瓶中，加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，分對(duì)照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC組(50 μmol/L)和塞來昔布+PDTC(25/25 μmol/L)4組。培養(yǎng)48 h后除去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，70%預(yù)冷(-20℃)乙醇固定，過夜。吸去乙醇，PBS沖洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入RNase酶(20 μg/ml)200 μl消化30 min，加入1 ml碘化丙啶(20 μg/ml)，于室溫遮光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組重復(fù)3次，Cell Quest及Modifit軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-2Z細(xì)胞，制成5×104/ml濃度細(xì)胞懸液，接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，每孔2 ml，放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁后分四組，分別為對(duì)照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)組和塞來昔布(25 μmol/L)+ PDTC(25 μmol/L)組。培養(yǎng)24 h，更換無藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，95%的乙醇室溫固定30 min后，PBS洗滌3次，取出蓋玻片，常規(guī)SP法免疫化學(xué)染色，DAB顯色，晾干封片后光鏡下觀察。CNE-2Z細(xì)胞中NF-κB陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿和細(xì)胞核中可見棕黃色顆粒；COX-2陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為為細(xì)胞漿可見棕黃色顆粒。HSCORE評(píng)分：排除爬片邊緣細(xì)胞，在低倍鏡下隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻的視野10個(gè)，然后在高倍鏡下每個(gè)視野隨機(jī)選50個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞漿或核著色深淺進(jìn)行NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)評(píng)分：(1)陰性：0分，不著色；(2)弱陽性：1分，淡黃色；(3)陽性：2分，黃色；(4)強(qiáng)陽性：3分，深棕色。根據(jù)公式HSCORE=ΣPi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示評(píng)分為i的比例)計(jì)算細(xì)胞HSCORE得分[3]。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)細(xì)胞濃度調(diào)為1.0×104ml，接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁后分四組，分為對(duì)照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)組和塞來昔布(25 μmol/L)+PDTC(25 μmol/L)組。培養(yǎng)24 h，均更換無藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入蛋白質(zhì)裂解液100 μl，在冰浴條件下靜置裂解30 min，上離心機(jī)離心5 min后收集上清液，用考馬斯蘭亮法定量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜。將硝酸纖維素膜放人含一抗Caspase-3抗體的封閉液中，4℃過夜，電轉(zhuǎn)液洗3次，每次10 min。放人含辣根酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG二抗抗體的封閉液中，室溫2 h，電轉(zhuǎn)液洗3次，每次10 min。將膜放在保鮮膜上，檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)，并用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)藥物對(duì)CNE-2Z鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率的影響塞來昔布+PDTC組對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于塞來昔布組、PDTC組對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組藥物不同時(shí)間對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(n=5，%，±s)

表1 各組藥物不同時(shí)間對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(n=5，%，±s)

別24 h 48 h 72 h塞來昔布組TC組來昔布+PDTC組值30.21±6.42 35.78±6.33 51.20±3.12 19.48 4472 PD塞F P值＜0.05 7.35±7.11 4.56±6.47 0.34±4.68 6.26＜0.05 52.64±5.97 50.63±5.52 88.32±3.89 81.89＜0.05

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布塞來昔布組、PDTC組及塞來昔布+PDTC組分別作用48 h后，CNE-2Z細(xì)胞的細(xì)胞周期分布見表2。塞來昔布+ PDTC組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，細(xì)胞呈現(xiàn)G0/G1期阻滯，抑制效果更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞周期的變化(n=3，%，±s)

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞周期的變化(n=3，%，±s)

組別G0/G1期S期G2/M期對(duì)照組塞來昔布組PDTC組塞來昔布+PDTC組F值P值66.84±5.21 81.66±7.80 80.54±5.14 92.52±4.68 9.75＜0.05 21.11±2.21 8.72±1.22 9.87±2.13 4.39±1.92 41.76＜0.05 12.05±1.73 9.62±1.06 9.59±1.44 3.09±1.18 23.36＜0.05

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NF-κB和COX-2蛋白的表達(dá)NF-κB和COX-2在各組CNE-2Z細(xì)胞表達(dá)呈陽性，分別在細(xì)胞核和細(xì)胞漿有黃色顆粒。與對(duì)照組、塞來昔布組、PDTC組比較，塞來昔布+PDTC組NF-κB、COX-2的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組免疫組化染色評(píng)分見表3。

表3 各組細(xì)胞中NF-κB、COX-2免疫組化染色和組織學(xué)評(píng)分(分，±s，n=12)

表3 各組細(xì)胞中NF-κB、COX-2免疫組化染色和組織學(xué)評(píng)分(分，±s，n=12)

組別NF-κB COX-2對(duì)照組塞來昔布組PDTC組塞來昔布+PDTC組F值P值2.76±0.53 2.13±0.46 1.86±0.35 1.08±0.31 32.70＜0.05 2.56±0.43 1.55±0.29 1.97±0.32 1.17±0.28 37.89＜0.05

2.4 Western blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)塞來昔布組、PDTC組和塞來昔布+PDTC組與對(duì)照組比較，Caspase蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；塞來昔布+PDTC組與單獨(dú)用藥組比較，Caspase-3表達(dá)增高更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)注：1～4泳道分別為對(duì)照組、塞來昔布組、PDTC組和塞來昔布+PDTC組。

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與多種細(xì)胞因子相關(guān)，如COX-2、NF-κB等在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及凋亡等均有相關(guān)性[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用塞來昔布與PDTC聯(lián)合作用于鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞，與單用一藥比較，其抑制生長(zhǎng)增殖作用更顯著。NF-κB具有抑制細(xì)胞凋亡和參與調(diào)控細(xì)胞周期的雙重功效，其抑制細(xì)胞凋亡可能是通過誘導(dǎo)阻止凋亡進(jìn)程的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，包括Bcl-2家族的成員、細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族等[6]。有研究在22只人乳腺導(dǎo)管癌裸鼠的腫瘤組織中檢測(cè)NF-κB、Caspas-3的表達(dá)，結(jié)果顯示NF-κB與Caspas-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其機(jī)制可能是各種凋亡相關(guān)因子作用于Caspas-3的前體，使前體轉(zhuǎn)化為有活性的Caspase-3，激活了DNA酶，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)染色體聚集、斷裂或細(xì)胞骨架降解，從而引起細(xì)胞凋亡[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示塞來昔布、PDTC單獨(dú)應(yīng)用可以抑制鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，表現(xiàn)為CNE-2Z細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增多，S期及G2/M期細(xì)胞減少，CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)過程明顯受阻于G0/G1期。塞來昔布與PDTC聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞生長(zhǎng)過程受阻于G0/G1期更顯著。免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)中，Cox-2、NF-κB表達(dá)陽性，二藥聯(lián)用比單獨(dú)應(yīng)用一種藥物其表達(dá)降低更明顯。從蛋白水平分析，二藥聯(lián)用后Caspase-3表達(dá)升高，可能是通過Cox-2、NF-κB途徑抑制了鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[8]。NF-κB是一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，是由p65和p50構(gòu)成的雜二聚體，參與真核細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，其抑制細(xì)胞凋亡的作用可能與凋亡相關(guān)抑制蛋白家族中某些成員有關(guān)，抑制NF-κB活性可以誘導(dǎo)家族中某些因子的表達(dá)變化，從而促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)提示Cox-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z生長(zhǎng)增殖有抑制作用，其協(xié)同促進(jìn)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z凋亡機(jī)制有待進(jìn)一步研究。隨著更多相關(guān)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，塞來昔布、PDTC的作用機(jī)制會(huì)更加明確，它們將成為很有前景的抗腫瘤藥物。

[1]張繼屏,范靜平,鄧月,等.Ki67和nm23蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)眼耳鼻喉科雜志,2015,15(1):20-24.

[2]向銀洲,余林,魏蓮枝,等.冬凌草甲素對(duì)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株生長(zhǎng)及PCNA、Caspase-3表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2010,50(50): 20-22.

[3]Cetinkaya BO,Pamuk F,Keles GC,et al.The role of phosphatase and tensin homolog in drug-induced gingival overgrowth[J].Periodontal Res,2014,49(3):307-313.

[4]向銀洲,魏蓮枝,李潔.塞來昔布對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z作用的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,32(11):1154-1157.

[5]Ji X,Usman A,Razalli NH,et al.Oil palm phenolics(OPP)inhibit pancreatic cancer cell proliferation via suppression of NF-κB pathway[J].Anticancer Res,2015,35(1):97-106.

[6]Bose RN.Biomolecular targets for platinum antitumor drugs[J]. Mini Rev Med Chem,2002,2(2):103-111.

[7]張丹,呂亮,申興斌,等.大腸癌凋亡相關(guān)因子表達(dá)的研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,30(2):158-161.

[8]Liao X,Che X,Zhao W,et al.The β-adrenoceptor antagonist,propranolol,induces human gastric cancer cell apoptosis and cell cycle arrest via inhibiting nuclear factor κB signaling[J].Oncol Rep,2010, 24(6):1669-1676.

[9]張純,崔國(guó)惠,劉芳.NF-κB抑制劑PDTC抗白血病細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(12):2349-2352.

Effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Zcell lines.

XIANG Yin-zhou,GU Yu,PENG Ping,XU Jun,NING Na.Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Three Gorges University,the First People's Hospital of Yichang

ObjectiveTo study the sound effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)on the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cell lines and the possible mechanisms.MethodsThe experiment enrolled 4 groups:control group(without drug),celecoxib group(celecoxib 50 μmol/L),PDTC group(PDTC 50 μmol/L)and celecoxib+PDTC group(celecoxib 25 μmol/L+PDTC 25 μmol/L). The inhibition rate of cell growth was detected by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric(MTT)method.The tumor cell cycle was analyzed by flow cytometry.The expressions of nuclear factor kappa B(NF-κB)and cyclooxygenase (COX)-2 were examined by immunocytochemistry method.The expression of cysteinyl aspartate specific proteinase (caspase)-3 was tested by Western blot.ResultsThe proliferation activity of nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells with celecoxib,PDTC,celecoxib+PDTC processing(24 h,48 h and 72 h)all were inhibited significantly(P＜0.05).Compared to PDTC group and celecoxib group,the inhibition rate of celecoxib+PDTC group showed significant difference (P＜0.05).Treated by Celecoxib and PDTC for 48 h,cell cycle was prevented in G0/G1phase.Cell percentage in G0/G1phase was significantly higher than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05).The result of immunocytochemical staining indicated that the expressions of NF-κB and COX-2 in celecoxib+PDTC group were significantly lower than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05),and Western blot indicated that the expression of caspase-3 in celecoxib+PDTC group was significantly higher(P＜0.05).ConclusionCOX-2 inhibitor celecoxib combined with PDTC can inhibit the proliferation of CNE-2Z cell lines.Its possible mechanism is to decrease the expressions of COX-2 and NF-κB,and enhance the expression of caspase-3 protein.

Celecoxib;Pyrrolidine dithiocarbamate;Human nasopharyngeal carcinoma cell line;Inhibition

R739.63

A

1003—6350（2016）01—0007—03

2015-07-13)

湖北省宜昌市科技局基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：A14301-16)

向銀洲。E-mail：2402342279@qq.com