張曉微，王藝，趙雪峰

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院普通外科，遼寧大連116021)

HOXB6在裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型抑癌機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

張曉微，王藝，趙雪峰

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院普通外科，遼寧大連116021)

目的研究HOXB6在裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型抑癌機(jī)制及其前臨床意義。方法采用基因重組質(zhì)粒pcDNA6-HOXB6轉(zhuǎn)染的HT29大腸癌細(xì)胞株建立裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分為兩組，即HOXB6組和對照組。制模30 d后觀察兩組間轉(zhuǎn)移瘤形成情況及生存情況。結(jié)果HOXB6組平均體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝轉(zhuǎn)移評分及血性腹水生成率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為20.04 g與23.08 g，P＜0.01；1.54 g與2.22 g，P＜0.01；0.60與3.80，P＜0.01；0與80.0%，P＜0.05)；兩組生存曲線分析顯示，HOXB6組生存率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論HOXB6可抑制裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成，且可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的評判指標(biāo)。

HOXB6；裸鼠；大腸癌；肝轉(zhuǎn)移

同源盒基因(HOX基因)是調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和分化的主宰基因，近期研究報(bào)道其對胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[1]。其中，HOXB6與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。同時，還深入到大腸癌患者的早期診斷、術(shù)前分期判斷及預(yù)后的評估中[3]。但真正推廣于臨床腫瘤標(biāo)記物，有待于大樣本的調(diào)查和前臨床試驗(yàn)作為鋪墊。本研究首次采用裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型來探討HOXB6的抑癌機(jī)制及其前臨床試驗(yàn)中的意義，進(jìn)一步明確HOXB6在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的地位，以期為制備HOXB6相關(guān)抗體來針對大腸癌進(jìn)行敏感性靶向治療和腫瘤的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料HT29人大腸癌細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞研究所。轉(zhuǎn)染基因重組質(zhì)粒pcDNA6-HOXB6及pcDNA6-scramble的大腸癌細(xì)胞由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。RPMI-1640和新生胎牛血清購自Invirtogen，10只6周齡雌性BALB/c裸鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及懸液制備常規(guī)無菌培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染的HT29人大腸癌細(xì)胞株，細(xì)胞融合至90%以上時收集細(xì)胞并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整至細(xì)胞濃度為5×107/ml。細(xì)胞混懸液置于冰中待接種。

1.2.2 模型設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)動物購入后在模型前1周防止進(jìn)行任何刺激性操作。裸鼠共10只，隨機(jī)劃分成HOXB6組5只和對照組5只，制模后觀察4周。

1.2.3 大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立[4]選擇異氟醚進(jìn)行全身麻醉。取5 mm小切口入腹后輕輕牽出大網(wǎng)膜和脾臟。選擇脾臟被摸中點(diǎn)，采用G31注射器進(jìn)針2 mm左右，穩(wěn)定注入已轉(zhuǎn)染的HT29人大腸癌細(xì)胞混懸液100 μl，止血紗布壓迫注射部位前可見其周圍有顏色改變及腫脹。數(shù)分鐘后離斷脾臟動靜脈，從腹腔中移除脾臟，逐層關(guān)腹。

1.2.4 大腸癌肝轉(zhuǎn)移評分標(biāo)準(zhǔn)肝轉(zhuǎn)移評分標(biāo)準(zhǔn)如下，0：沒有肝轉(zhuǎn)移；1：肝臟浸及為輕微，浸潤范圍＜0.5 cm2；2：肝臟浸及為輕度，浸潤范圍0.5～1.0 cm2；3：肝臟浸及為中度，浸潤范圍1.0～2.0 cm2；4：肝臟浸及為重度，浸潤范圍2.0 cm2以上。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)及項(xiàng)目每天常規(guī)觀察并記錄裸鼠的一般狀態(tài)。裸鼠出現(xiàn)頻死前癥狀或觀察期滿4周時予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移癌情況，具體記錄裸鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝轉(zhuǎn)移評分及是否存在血性腹水等，移除之肝轉(zhuǎn)移病灶采取病理檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXB6對裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移癌形成情況HOXB6組平均體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝轉(zhuǎn)移評分及血性腹水生成率顯著少于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.0)，見表1。大體觀及纖維鏡下結(jié)果顯示，HOXB6組轉(zhuǎn)移癌浸潤生長緩慢，但對照組轉(zhuǎn)移癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和局部浸潤生長迅猛，見圖1。

表1 兩組裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移癌形成情況比較(±s)

表1 兩組裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移癌形成情況比較(±s)

組別肝轉(zhuǎn)移分級無有體質(zhì)量(g)肝質(zhì)量(g) HOXB6組對照組檢驗(yàn)值P值20.04±0.86 23.08±0.63 t=5.403 0.006 1.54±0.11 2.22±0.08 t=8.552 0.001 0.60±0.15 3.80±0.45 t=10.251 0.006 5(100.0) 1(20.0) 0(0.0) 4(80.0) χ2=6.667 0.016

圖1 裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的HOXB6組和對照組在大體肉眼上和顯微鏡下改變。大體上主要觀察有無血性腹水、腹膜種植轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移評分；顯微鏡下主要觀察癌細(xì)胞的分布，放大倍數(shù)為100倍，其刻度標(biāo)尺為100 μm.

2.2 HOXB6對裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的生存率情況每天觀察裸鼠一般狀態(tài)，飼養(yǎng)4周成功模型共10只，死亡5只。其中HOXB6組平均生存時間為3.94周，對照組平均生存時間為2.40周。HOXB6組累計(jì)生存率為80%(4/5)，對照組累計(jì)生存率為20%(1/5)。Live tables證實(shí)，HOXB6組4周累計(jì)生存曲線明顯高于對照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)，見圖2。

圖2 HOXB6組和對照組裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的累計(jì)生存曲線

3 討論

在大腸癌患者中肝轉(zhuǎn)移非常常見，手術(shù)仍是最有效的治愈手段。然而，80%～90%的絕大多數(shù)肝轉(zhuǎn)移灶在起初時是無法根治性切除的，故肝轉(zhuǎn)移成為了大腸癌患者最主要的死亡原因[5]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，越來越多與大腸癌相關(guān)的生物標(biāo)記物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。在轉(zhuǎn)移性大腸癌患者的治療中添加生物靶向治療，可使一部分患者獲益，如何篩選這部分患者成為深受關(guān)注的話題[6-7]。但這一重要的課題遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了疾病的多樣化、異常化、變異化趨勢。因此，新的腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和腫瘤預(yù)防制劑的研發(fā)，對癌腫的防治皆為關(guān)鍵。

HOX基因是轉(zhuǎn)錄調(diào)控或多種生長因子通路的樞紐因子，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。近年來，對HOX基因的研究主要集中于發(fā)育過程中，而對于HOX家族的39個成員的前臨床和亞臨床的研究仍處于起步階段，至今為止只有少量的證據(jù)提示HOX家族在腫瘤形成過程中的抑制或促進(jìn)作用機(jī)制[8]。非?？上У氖牵噲D對HOX基因應(yīng)用于臨床，但對特異性HOX基因的變化被提示患者需要更加積極的診治方案[9]。其中，HOXB6為抑癌基因，是與人胃腸黏膜發(fā)育及形態(tài)成密切相關(guān)的基因[10]。已研究發(fā)現(xiàn)，HOXB6還與結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。加上，HOXB6基因的檢測只需結(jié)直腸鏡活檢中的微量的標(biāo)本，此為HOXB6基因研究添加了一個重要的砝碼。

癌腫遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有高度的選擇性和較強(qiáng)的器官特異性，例如大腸癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移[11]。大腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究基礎(chǔ)依然是建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移模型。本研究選用了先天無胸腺和體內(nèi)無T細(xì)胞的裸鼠，并選擇了經(jīng)脾注射法。此法能使癌細(xì)胞有充裕的時間轉(zhuǎn)移到肝臟，并切除主要免疫器官之脾臟，也符合單向性肝轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)思，更有助于研究單純性肝轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，HOXB6基因?qū)Υ竽c癌肝轉(zhuǎn)移模型有明顯的抑癌機(jī)制。對HOXB6組進(jìn)行解剖觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性肝癌形成緩慢均衡，不伴有血性腹水及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且4周累積生存率明顯高于對照組。在HOXB6組肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的生長增殖能力鑒定中，發(fā)現(xiàn)其生長繁殖能力不抵于侵襲能力。另一種解釋方法是，雖然HOXB6組的肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞具備較強(qiáng)的侵襲能力，可其生長增殖能力相比較差。我們的研究結(jié)果打破了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長主流，這一結(jié)局關(guān)系到HOXB6基因的抗轉(zhuǎn)移作用。至于相關(guān)的抑制轉(zhuǎn)移機(jī)理和具體的HOXB6基因傳導(dǎo)通路有待于更進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，HOXB6可抑制裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成，并且可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的評判指標(biāo)。但有必要進(jìn)行亞臨床研究來證實(shí)其量化效果，同時要不斷進(jìn)行對HOXB6基因抗轉(zhuǎn)移作用機(jī)理的研究。

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Tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 in nude mice models of liver metastasis of colon cancer.

ZHANGXiao-wei,WANG Yi,ZHAO Xue-feng.Department of General Surgery,Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116021,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo study the tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 gene in nude mice models of liver metastasis of colon cancer and its preclinical significance.MethodsHT29 colon cancer cells transfected by recombinant vector pcDNA6-HOXB6 gene were used to establish nude mice models of liver metastasis of colon cancer.The models were divided into two groups:HOXB6 group and control group.The formation situation of metastatic tumor and the survival status of nude mice models in the two groups were studied 30 d after the establishment of models. ResultsThe mean body weight,liver weight,liver metastasis scores and bloody ascites rate of HOXB6 group were significantly less or lower than those in the control group(20.04 g vs 23.08 g,P＜0.01;1.54 g vs 2.22 g,P＜0.01;0.60 vs 3.80,P＜0.01;0 vs.80.0%,P＜0.05).Survival curves showed that the survival rate in HOXB6 group was significantly higher than that in the control group(P=0.034).ConclusionHOXB6 gene may inhibit the formation of liver metastasis of colon cancer in nude mices,and it can be regarded as an indicator for evaluating tumor metastasis.

HOXB6;Nude mice;Colon cancer;Liver metastasis

R-332

A

1003—6350（2016）01—0001—03

大連大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目(編號：20151QL019)

趙雪峰。E-mail：zhaoxuefeng74@hamail.net