李美艷，盧靜，韓新彥，王菊榮

(邯鄲市中心醫(yī)院婦一科1、生殖醫(yī)學(xué)科2，河北邯鄲056008)

蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2與接頭蛋白Gab2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

李美艷1，盧靜2，韓新彥1，王菊榮1

(邯鄲市中心醫(yī)院婦一科1、生殖醫(yī)學(xué)科2，河北邯鄲056008)

目的探討蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2與接頭蛋白Gab2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、兩者的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法，檢測(cè)50例子宮內(nèi)膜癌（癌組）、50例子宮內(nèi)膜不典型增生（癌前病變組）及30例正常增殖期子宮內(nèi)膜(正常組)中Shp2蛋白和Gab2蛋白的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，及二者的相關(guān)性。結(jié)果正常組、癌前病變組和癌組的子宮內(nèi)膜組織中，Shp2蛋白的陽性表達(dá)率分別為0、12.00%、64.00%，Gab2蛋白的陽性表達(dá)率分別為3.33%、38.00%、58.00%，且組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Shp2蛋白及Gab2蛋白的陽性表達(dá)率在肌層浸潤(rùn)深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；多因素生存分析顯示：Shp2蛋白陽性表達(dá)者的總生存率明顯下降，Gab2蛋白陽性表達(dá)者總生存率也明顯下降；子宮內(nèi)膜癌中Shp2蛋白的表達(dá)與Gab2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.368，P＜0.05)。結(jié)論Shp2蛋白及Gab2蛋白的表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)等過程，有可能作為判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的新指標(biāo)。

子宮內(nèi)膜癌；Shp2蛋白；Gab2蛋白；免疫組織化學(xué)

細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)中，蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與磷酸化水平異常相關(guān)。Shp2(Protein tyrosine phosphatase 2)蛋白是第1個(gè)被確定的具有磷酸酶活性的促腫瘤蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，Shp2蛋白在肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1-2]。Gab2蛋白可介導(dǎo)多種細(xì)胞外刺激引起的信號(hào)傳遞，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及遷移等生理過程中發(fā)揮重要作用，而Shp2蛋白和Gab2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況，國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本文采用免疫組化技術(shù)探討子宮內(nèi)膜癌中Shp2蛋白和Gab2蛋白的表達(dá)及與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在為子宮內(nèi)膜癌臨床治療指導(dǎo)及預(yù)后評(píng)估提供有價(jià)值的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2004年6月至2014年6月在邯鄲市中心醫(yī)院住院治療的患者130例，年齡30～75歲，平均49.56歲，中位年齡49.00歲，95%CI(44.50，54.20)歲。其中Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌50例(癌組)，不典型增生的子宮內(nèi)膜50例(癌前病變組)，正常增殖期子宮內(nèi)膜30例(正常組)，正常增殖期子宮內(nèi)膜及不典型增生的子宮內(nèi)膜均來自于診刮及手術(shù)切除子宮的內(nèi)膜標(biāo)本。子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期按2009年FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，Ⅰ期24例，Ⅱ期17例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例；高分化(G1)22例，中分化(G2)18例，低分化(G3)10例；肌層浸潤(rùn)深度＜1/2肌層31例，≥1/2肌層19例；伴有淋巴轉(zhuǎn)移的10例，無淋巴轉(zhuǎn)移的40例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療，無手術(shù)禁忌，進(jìn)行書信、電話、騰訊QQ和微信隨訪，隨訪時(shí)間截止到2014年6月，臨床資料完整。由兩位病理醫(yī)生復(fù)習(xí)病理切片，并選取包含腫瘤組織的石蠟標(biāo)本備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)SP法，染色步驟按試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.3 試劑Shp2蛋白為兔抗人多克隆抗體與Gab2蛋白為兔抗人單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，SP廣譜超敏試劑盒、PBS緩沖液、DAB酶底物顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)雙盲狀態(tài)下對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性判斷參照文獻(xiàn)[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法；兩者相關(guān)性用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析，并繪制生存曲線，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Shp2蛋白、Gab2蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)Shp2蛋白和Gab2蛋白均定于細(xì)胞質(zhì)，陽性以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒(見圖1、圖2)，陰性對(duì)照為無著色(見圖3)。由Shp2蛋白和Gab2蛋白的組織表達(dá)(見表1)可見，在子宮內(nèi)膜癌中Shp2蛋白、Gab2蛋白的陽性表達(dá)率均顯著高于正常組和癌前病變組，且組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Shp2：χ2=47.482，P=0.00＜0.05；Gab2：χ2=14.268，P=0.00＜0.05)。

表1 Shp2蛋白和Gab2蛋白在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá)(例)

圖1 Shp2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)(×200)；圖2Gab2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)(×400)；圖3Shp2蛋白、Gab2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中陰性表達(dá)(×200)

2.2 Shp2蛋白、Gab2蛋白與子宮內(nèi)膜癌臨床參數(shù)的關(guān)系Shp2蛋白的表達(dá)與手術(shù)病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(χ2值分別為8.315、6.376、 6.272，P＜0.05)，Gab2蛋白的表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2值分別為8.642、5.255，P＜0.05)，二者均與年齡無關(guān)(χ2值分別為0.643、0.384，P＞0.05)，見表2。

表2 Shp2蛋白和Gab2蛋白與子宮內(nèi)膜癌臨床參數(shù)的關(guān)系

2.3 Shp2蛋白和Gab2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的關(guān)系Shp2蛋白和Gab2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.368，P=0.009＜0.05)，見表3。

2.4 Shp2蛋白及Gab2蛋白與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系

表3 Shp2蛋白和Gab2蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

2.4.1 Shp2蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系采用逐步回歸法對(duì)Shp2蛋白表達(dá)進(jìn)行多因素Cox模型分析，配合模型時(shí)，進(jìn)入模型和從模型中剔除變量的水準(zhǔn)分別定為0.05和0.06，回歸分析后建立回歸方程，篩選出變量為X5(有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)：偏回歸系數(shù)B為1.793；偏回歸系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤SE為0.812；Wald值為4.874；P值為0.027；相對(duì)危險(xiǎn)度估計(jì)Exp（B）為6.006；95%置信區(qū)間下限為1.223、上限為29.499；生存曲線見圖4。

2.4.2 Gab2蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系采用逐步回歸法對(duì)Gab2蛋白表達(dá)進(jìn)行多因素Cox模型分析，配合模型時(shí)，進(jìn)入模型和從模型中剔除變量的水準(zhǔn)分別定為0.05和0.06，回歸分析后建立回歸方程中的變量如表4；生存曲線見圖5。

表4 Gab2蛋白Cox模型分析

圖4 Shp2蛋白陽性和陰性患者生存率

圖5 Gab2蛋白陽性和陰性患者生存率

3 討論

Shp2蛋白由PTPN11基因編碼，屬于非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員之一，是目前磷酸化酶中唯一已被證實(shí)的原癌基因，它通過調(diào)節(jié)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如Ras/ERK通路，PI3K/Akt/mTOR等)，參與細(xì)胞的存活、遷移、粘附、細(xì)胞骨架形成等從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌等惡性腫瘤中均表現(xiàn)為高表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Shp2蛋白在正常子宮內(nèi)膜，不典型增生子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜癌組中陽性表達(dá)率分別為：0、12.00%、64.00%，表現(xiàn)為逐漸增高趨勢(shì)，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過分析Shp2蛋白的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Shp2蛋白和子宮內(nèi)膜癌的FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，多因素Cox模型生存分析顯示，Shp2蛋白的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從生存曲線中看出，Shp2蛋白陽性者總生存率降低，可見與預(yù)后相關(guān)的因素主要為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，提示Shp2蛋白可能參與了子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)等過程，也進(jìn)一步證實(shí)了PTPN11/Shp2可能為一癌基因有關(guān)，這和王化淳等[5]在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究報(bào)道一致。這為臨床檢測(cè)Shp2蛋白表達(dá)水平預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)而判斷患者的預(yù)后情況提供理論依據(jù)。

Gab2蛋白屬于Gabs家族蛋白，基因定位于11q14.1，蛋白分子量97～100 kD，Gab2蛋白結(jié)構(gòu)中缺少催化區(qū)域，不能直接引起磷酸化反應(yīng)，但pH結(jié)構(gòu)域結(jié)合的位點(diǎn)使其能招募多種接頭蛋白及酶類分子，完成信號(hào)傳遞，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及遷移等生理過程中發(fā)揮重要作用。Gab2蛋白通過與ErbB2/Neu等原癌基因共同協(xié)作參與原位腫瘤到侵襲性腫瘤的轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移[6]。研究表明，Gab2是一種錨定蛋白，能夠介導(dǎo)Shp2蛋白在細(xì)胞中的定位，調(diào)控Shp2蛋白酪氨酸磷酸酶活性的發(fā)揮[7]。Brummer等[8]在乳腺癌相關(guān)研究中證實(shí)，Shp2蛋白通過與Gab2蛋白結(jié)合，參與PI3K/Akt途徑使人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)過表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡抑制、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)Gab2蛋白在人類白血病和卵巢癌中高表達(dá)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，Gab2蛋白的陽性表達(dá)率亦是逐漸遞增的趨勢(shì)(3.33%、38.00%、58.00%)，表達(dá)情況與肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，從生存曲線中可見Gab2蛋白陽性的患者生存率也逐漸下降，且對(duì)二者相關(guān)性分析顯示存在正相關(guān)(r=0.368，P=0.009＜0.05)，本實(shí)驗(yàn)與Brummer等[8]研究結(jié)果一致，可以推測(cè)Gab2蛋白與Shp2蛋白共同參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過程，有助于臨床醫(yī)師通過Shp2蛋白和Gab2蛋白的表達(dá)來判斷患者的預(yù)后情況。

總之，Shp2蛋白陽性和Gab2蛋白陽性者，患者的生存率降低，因此Shp2蛋白和Gab2蛋白可能為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷、預(yù)后判斷、監(jiān)測(cè)和基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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Expression and significance of protein tyrosine phosphatase Shp2 and adapter protein Gab2 in endometrialcarcinoma.

LI Mei-yan1,LU Jing2,HAN Xin-yan1,WANG Ju-rong1.The First Department of Gynaecology1,Department of Reproductive Medicine2,Handan Central Hospital,Handan 056008,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of protein tyrosine phosphatase 2(Shp2)and the adapter protein Gab2 in endometrial carcinoma,and to analyze the correlation between the two proteins as well as that between their expression and prognosis.MethodsThe expression levels of Shp2 protein and Gab2 protein were detected by immunohistochemical SP method in 50 patients of endometrial carcinoma(cancer group),50 patients of endometrial atypical hyperplasia(precancerous lesion group)and 30 subjects of normal proliferative phase endometrium(normal group). The correlation between the expression and the clinicopathological parameters of endometrial carcinoma were analyzed, as well as the correlation between the two proteins.ResultsThe positive expression rate of Shp2 protein was 0.00%, 12.00%,64.00%in normal group,precancerous lesion group,cancer group,respectively,and the positive expression of Gab2 protein was 3.33%,38.00%,58.00%,respectively,with statistically significant difference between the three groups (P＜0.05).The positive expression rate of Shp2 protein and Gab2 protein showed no statistically significant difference between groups of different muscle layer infiltration depth and the groups with or without lymph node metastasis(P＜0.05). Multivariate survival analysis showed that the total survival rate of patients with positive expression of Shp2 protein was decreased significantly,and the total survival rate of patients with positive expression of Gab2 protein was also significantly decreased.The expression of Shp2 protein was positively correlated with the expression of Gab2 protein in endometrial carcinoma(r=0.368,P＜0.05).ConclusionThe expression of Shp2 protein and Gab2 protein may be involved in the occurrence,development and infiltration process of endometrial carcinoma,what can be used as new prognostic indicators for evaluating the prognosis of endometrial carcinoma.

Endometrial carcinoma;Shp2 protein;Gab2 protein;Immunohistochemistry

R737.33

A

1003—6350（2016）01—0010—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.004

2015-03-13)

李美艷。E-mail：lmy-200602744@163.com