孫平，蔡妹群，董群偉，王曉東

(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨質(zhì)疏松基地1、骨科2，廣東廣州510080)

復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨量和骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的研究

孫平1，蔡妹群2，董群偉2，王曉東1

(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨質(zhì)疏松基地1、骨科2，廣東廣州510080)

目的觀察復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(FTZ)對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、生物力學(xué)特性和血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的影響。方法SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，隨機(jī)等分為四組：Nrm組為正常對(duì)照組，Met組皮下注射甲強(qiáng)龍(Met)5 mg/kg·d，每周5次，F(xiàn)TZL組和FTZH組在Met組基礎(chǔ)上每日分別給予低劑量FTZ(1.5 g/kg)和高劑量FTZ(6 g/kg)灌胃，實(shí)驗(yàn)期為12周。QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀測定股骨和腰椎骨密度，MTS-858型生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)測定股骨和腰椎生物力學(xué)性能。ELISA法測量血清中1型前膠原氨基末端前肽(P1NP)、Ⅰ型膠原羧基端肽(β-CTX)和骨鈣素(OC)含量。結(jié)果Met組大鼠股骨和腰椎的骨密度、最大載荷、剛度和血清OC、P1NP均顯著低于Nrm組相應(yīng)指標(biāo)(Ρ＜0.01)，血清β-CTX顯著高于Nrm組(Ρ＜0.01)；FTZL組大鼠的最大載荷、剛度和P1NP較Met組有升高趨勢，β-CTX有降低趨勢，但兩組間各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ＞0.05)；FTZL組大鼠L5的骨密度和血清OC明顯高于Met組(Ρ＜0.05)；FTZH組大鼠股骨和腰椎的骨密度、最大載荷、剛度、血清OC和P1NP顯著高于Met組相應(yīng)指標(biāo)(Ρ＜0.01)，β-CTX明顯低于Met組(Ρ＜0.05)；FTZH組大鼠腰椎的最大載荷、L5的骨密度和血清OC均明顯高于FTZL組(Ρ＜0.05)。結(jié)論FTZ能夠改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠股骨和腰椎的骨密度(BMD)及生物力學(xué)特性，改善骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)，效果顯著。

糖皮質(zhì)激素；復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊；骨密度；骨生物力學(xué)；骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)；骨質(zhì)疏松

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是糖皮質(zhì)激素治療炎癥和自身免疫性疾病最嚴(yán)重的副作用，其發(fā)生率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及老年性骨質(zhì)疏松癥而位居第3位[1]。有報(bào)道指出，糖皮質(zhì)激素首先是引起脂質(zhì)代謝紊亂，其次引起骨量減少，如近年來發(fā)現(xiàn)他汀類藥物在抗骨質(zhì)疏松的治療中起到積極作用[2-3]，但對(duì)肝臟、腎臟等副作用較明顯?；诖?，本研究選用我校自主創(chuàng)新研發(fā)的具有護(hù)肝調(diào)脂作用的復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(FTZ)，通過改善脂代謝失衡，以期對(duì)GIOP的防治起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組3個(gè)月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(210±15)g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)平均分為四組：Nrm組為正常對(duì)照組，Met組為皮下注射甲強(qiáng)龍(Met)5 mg/(kg·d)，每周5次[4]，低劑量組(FTZL)和高劑量組(FTZH)分別在Met組基礎(chǔ)上每天給予FTZ 1.5 g/kg和FTZ 6 g/kg灌胃，實(shí)驗(yàn)期12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后3.3%濃度的水合氯醛溶液(10 ml/kg)麻醉，左心室放血處死大鼠，留取血標(biāo)本做骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)檢測，雙側(cè)股骨及L4～5，剔除附著的軟組織，用浸濕生理鹽水的紗布包裹，置于置于-20℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)涔巧锪W(xué)和骨密度測定。

1.2 生物力學(xué)測定

1.2.1 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)取右側(cè)股骨，并剔除附著的軟組織，置于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(MTS-858型，USA)上，支點(diǎn)跨距17 mm，加壓點(diǎn)為中點(diǎn)，加載速度2 mm/min，加載至骨折，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，得出其力學(xué)參數(shù)。

1.2.2 壓縮試驗(yàn)去除L4椎弓及附件單留椎體，砂紙打磨椎體上下表面，使之相互平行，置于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(同上)上，下表面緊貼于不銹鋼板上，加載方向與不銹鋼表面垂直，加速度為2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，得出其力學(xué)參數(shù)。

1.3 股骨和L5骨密度測定采用QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀，小動(dòng)物梯級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分析軟件，掃描速度10 mm/s，掃描間距0.5 mm×0.5 mm。

1.4 血清標(biāo)本的檢測血清標(biāo)本用于大鼠骨鈣素(Osteocalcin，OC)、1型前膠原氨基末端前肽(N-terminal propeptide of type 1 procollagen，P1NP)、Ⅰ型膠原羧基端肽(C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen，β-CTX)的檢測，均采用大鼠OC、P1NP和β-CTX ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及方差分析(One-way ANOVA)，LSD多重檢驗(yàn)，以Ρ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTZ對(duì)大鼠骨生物力學(xué)參數(shù)的作用實(shí)驗(yàn)期滿后，Met組大鼠股骨和L4的最大載荷和剛度均顯著低于Nrm組相應(yīng)指標(biāo)(Ρ＜0.01)；FTZL組大鼠最大載荷和剛度較Met組有升高趨勢，但兩組間各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ＞0.05)；FTZH組大鼠股骨和L4的最大載荷、剛度均明顯高于Met組(Ρ＜0.05)；股骨的最大載荷和剛度FTZH組和FTZL組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ＞0.05)，但L4的最大載荷FTZH組明顯高于FTZL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ＜0.05)，見表1和表2。

表1 各組大鼠股骨(右)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)參數(shù)的結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠股骨(右)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)參數(shù)的結(jié)果(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.01，bP＜0.001；與Met組比較，cP＜0.05。

組別剛度(N/mm)標(biāo)本數(shù)最大載荷(N) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值222.92±25.85 168.09±30.01b182.31±21.20a201.53±17.04c7.859 0.000 8888 104.15±9.75 85.18±11.39a88.82±12.43a96.76±8.33c5.109 0.001

表2 各組大鼠L4壓縮試驗(yàn)參數(shù)的結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠L4壓縮試驗(yàn)參數(shù)的結(jié)果(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與Met組比較，dP＜0.05，eP＜0.01；與FTZL組比較，fP＜0.05。

組別標(biāo)本數(shù)最大載荷(N)剛度(N/mm) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值8888 107.32±9.57 83.03±11.95c87.11±12.03b99.35±11.36ef7.848 0.000 193.78±25.27 159.58±18.43b170.34±15.49a183.77±16.08d4.879 0.001

2.3 藥物對(duì)大鼠左側(cè)股骨和L5骨密度的作用四組大鼠間左側(cè)股骨和L5的骨密度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)，Met組顯著低于Nrm組(P＜0.001)；FTZH組股骨和L5骨密度均高于Met組(P＜0.01，P＜0.05)；FTZL組L5骨密度顯著高于Met組(P＜0.05)，F(xiàn)TZH組L5骨密度顯著高于FTZL組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠骨密度結(jié)果(g/cm2，±s)

表3 各組大鼠骨密度結(jié)果(g/cm2，±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.01，bP＜0.001；與Met組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與FTZL組比較，eP＜0.05。

組別Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值標(biāo)本數(shù)L50.228±0.007 0.208±0.005b0.214±0.006bc0.220±0.005ade24.45 0.000 8888股骨0.237±0.011 0.210±0.007b0.217±0.008b0.225±0.005ad15.535 0.000

2.4 藥物對(duì)大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的作用實(shí)驗(yàn)期滿后，Met組OC和P1NP顯著低于Nrm組(P＜0.001)，β-CTX顯著高于Nrm組(P＜0.01)；FTZL組OC較Met組顯著升高(P＜0.05)，P1NP有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；β-CTX有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；FTZH組OC和P1NP較Met組顯著性升高(P＜0.001，P＜0.05)，β-CTX顯著性降低(P＜0.05)；FTZH組OC較和FTZL組顯著性增加(P＜0.05)；余各指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的變化(±s)

表4 各組大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的變化(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與Met組比較，dP＜0.05，eP＜0.001；與FTZL組比較，fP＜0.05。

組別標(biāo)本數(shù)OC(μg/L)P1NP(ng/ml)β-CTX(pg/ml) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值8888 2.76±0.18 1.56±0.10c1.72±0.11cd1.90±0.13cef129.195 0.000 308.03±71.95 180.91±54.27c242.35±51.36a260.11±62.25d6.037 0.000 21.21±15.17 43.17±13.90b36.05±13.50a29.37±10.08d3.979 0.003

3 討論

長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可抑制骨基質(zhì)礦化，減少性激素分泌，抑制腸道對(duì)鈣的重吸收，增加腎臟對(duì)鈣、磷的排泄，增加骨吸收；同時(shí)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，降低成骨細(xì)胞增殖和活性，抑制骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)、胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制骨形成。GIOP是醫(yī)源性骨質(zhì)疏松的最常見原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在接受糖皮質(zhì)激素治療的慢性疾患者群中，最終有30%～50%發(fā)展為骨質(zhì)疏松，有超過1/3的絕經(jīng)后婦女長期(＞6個(gè)月)口服糖皮質(zhì)激素治療，椎體至少發(fā)生過1次椎體骨折[5]，且絕經(jīng)后婦女及長期使用糖皮質(zhì)激素的患者往往同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松和脂質(zhì)代謝紊亂[6-7]，有學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女的血清低密度脂蛋白水平與股骨頸及全髖BMD呈顯著負(fù)相關(guān)[8]，膽固醇和低密度脂蛋白水平與股骨頸和腰椎BMD亦呈顯著負(fù)相關(guān)[9]，而在抗骨質(zhì)疏松治療的過程中，脂代謝紊亂往往會(huì)得以逆轉(zhuǎn)，因此高脂血癥與骨質(zhì)疏松癥兩者在發(fā)病機(jī)制及臨床治療方面的相互關(guān)系已引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

回顧GIOP的治療，目前仍沒有理想方法，原因是由此引起的骨質(zhì)疏松機(jī)制復(fù)雜。中藥尤其是中藥復(fù)方具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)器官發(fā)揮功效的特點(diǎn)，中藥復(fù)方也體現(xiàn)了中醫(yī)的思想，即針對(duì)疾病本身起作用，又對(duì)其并發(fā)癥有很好的療效，其在防治脂質(zhì)代謝紊亂及骨質(zhì)疏松方面，有著較大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。我校自主研發(fā)的具有護(hù)肝調(diào)脂作用的FTZ以佛手、黃連、杜仲、白術(shù)、丹參等為主要成分，具有調(diào)脂、降糖、抑斑塊、保護(hù)內(nèi)皮等一系列作用。唐春萍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ能有效調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔的脂代謝異常，顯著降低非酒精性脂肪肝大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)，下調(diào)大鼠肝組織中LXR-α和SREBP-1c mRNA的表達(dá)，對(duì)高脂血癥相關(guān)的HMG-CoA還原酶(HMGR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等均有潛在作用[11-13]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該藥物能夠顯著增加大鼠皮質(zhì)骨厚度和骨小梁數(shù)目，因此本研究以降脂為基點(diǎn)，分別采用高、低劑量的FTZ以期觀察其對(duì)GIOP大鼠的骨量和骨質(zhì)量具有積極作用。

BMD是診斷骨質(zhì)疏松癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以間接評(píng)價(jià)骨質(zhì)健康情況及骨強(qiáng)度，同時(shí)可以提示超過60%的骨量變化，能夠較好地預(yù)測骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD較正常組均顯著下降，說明本實(shí)驗(yàn)采用甲強(qiáng)龍致大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功，F(xiàn)TZH組能夠顯著增加GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD，F(xiàn)TZL組僅能夠顯著增加腰椎BMD，且FTZH組顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠增加GIOP大鼠的BMD，特別是松質(zhì)骨的BMD，有效延緩糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨量丟失，且呈劑量依賴性。骨生物力學(xué)是全面評(píng)價(jià)骨質(zhì)量最可靠的指標(biāo)，是骨量、骨結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度的綜合體現(xiàn)，在評(píng)價(jià)治療骨質(zhì)疏松藥物對(duì)骨質(zhì)量影響中的作用無法被其他測定方式所取代。其中三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)主要反映皮質(zhì)骨的力學(xué)特性，壓縮實(shí)驗(yàn)主要是松質(zhì)骨力學(xué)特性的體現(xiàn)。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GIOP大鼠股骨和腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性(最大載荷)、材料力學(xué)特性(剛度)均較正常組顯著降低，與其BMD的下降相一致，通過給予FTZH可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性，在股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中，高、低劑量的FTZ兩組間未見顯著性差異；而在腰椎壓縮實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TZH組的最大載荷顯著優(yōu)于FTZL組，表明高劑量的FTZ對(duì)提高骨生物力學(xué)特性方面有積極作用，且呈劑量依賴性，特別是對(duì)松質(zhì)骨力學(xué)特性的改善作用。

骨轉(zhuǎn)換的過程是成骨細(xì)胞形成新骨和破骨細(xì)胞吸收舊骨的過程，在此過程中，成骨、破骨標(biāo)志物進(jìn)入血清，且濃度發(fā)生變化，反映了骨重建的動(dòng)態(tài)變化，檢測具有代表意義的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物，有利于分析藥物對(duì)機(jī)體骨重建的影響和藥物療效的評(píng)價(jià)。血清OC、P1NP和β-CTX是目前臨床常用的骨形成及骨吸收的生化標(biāo)志物，本研究提示，糖皮質(zhì)激素干預(yù)12周后的大鼠血清OC、P1NP較正常對(duì)照組顯著降低，β-CTX較對(duì)照組顯著升高，提示糖皮質(zhì)激素干預(yù)大鼠的成骨細(xì)胞活性降低、破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，即骨形成減少，骨吸收增加，與GIOP以骨形成缺陷為主，骨重建功能減退一致。這也與以往報(bào)道相一致[14-15]，在使用糖皮質(zhì)激素后患者血清P1NP濃度較對(duì)照組明顯降低，β-CTX濃度則明顯升高，提示骨代謝以骨形成降低，骨吸收增加為主；但亦有研究提示[16]給予糖皮質(zhì)激素干預(yù)后大鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性均增強(qiáng)，與本研究結(jié)果不符，可能與藥物劑型、藥物劑量及觀察時(shí)間等不同有關(guān)。本研究給予FTZH能夠顯著增加大鼠血清OC和P1NP水平，顯著降低β-CTX水平，且FTZH組血清OC水平顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠增加GIOP大鼠的骨形成，抑制骨吸收，改善骨重建。

本研究結(jié)果初步表明，具有護(hù)肝調(diào)脂作用的FTZ能夠改善GIOP大鼠的骨量丟失，增加BMD，維持骨生物力學(xué)特性，改善骨質(zhì)量，降低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這提示FTZ在減緩骨丟失、改善骨質(zhì)量、降低骨折的發(fā)生方面有一定的積極作用。本研究只是初步觀察了FTZ對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用的同時(shí)給我們提供了新的思路和方法，后續(xù)FTZ對(duì)骨代謝的影響及其機(jī)制方面的探討目前正在進(jìn)行中。

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Effects of Fufang Zhenzhu Tiaozhi on bone mass and bone turnover markers in rat models withglucocorticoid-induced osteoporosis.

SUN Ping1,CAI Mei-qun2,DONG Qun-wei2,WANG Xiao-dong1.Department of Osteoporosis1,Department of Orthopedics2,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of Fufang Zhenzhu Tiaozhi(FZT)Capsule on bone mineral density(BMD),biomechanics of femur and lumbar vertebra,and bone turnover markers in rat models with glucocorticoid-induced osteoporosis.MethodsThirty two male SD rats of SPF grade were randomized into four groups: normal control group(Nrm group),methylprednisolone group(Met group,hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week),FTZL group(hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week plus gavage administration of FTZ 1.5 g/kg per day),FTZH group(hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week plus gavage administration of FTZ 6 g/kg per day).The study period was 12 weeks.BMD of femur and lumbar vertebra was detected by dual energy X-ray absorptiometry(DXA,QDR4500A),and biomechanics of femur and lumbar vertebra were tested by MTS 858 MiniBionixⅡtesting system.The serum levels of N-terminal propeptide of type 1 procollagen(P1NP),C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen(β-CTX) and osteocalcin(OC)were determined by ELISA.ResultsMet group was significantly lower than Nrm group in BMD,maximum load,rigidity of femur and lumbar vertebra,as well as serum OC,P1NP levels(Ρ＜0.01),while Met group had significantly higher β-CTX(Ρ＜0.01).Maximum load,rigidity,P1NP and β-CTX were slightly higher in FTZL group than Met group,but β-CTX was slightly lower,with no statistically significant difference between the two groups(Ρ＞0.05).In FTZL group,BMD of fifth lumbar vertebrae(L5)and serum OC were significantly higher than those in Met group(Ρ＜0.05).In FTZH group,BMD,maximum load,rigidity,OC and P1NP were significantly higher than those in Met group(Ρ＜0.01),while β-CTX was significantly lower(Ρ＜0.05).FTZH had significantly higher maximum load,L5 BMD and OC than FTZL group(Ρ＜0.05).ConclusionFTZ has active effect on the BMD,biomechanics of femur and lumbar vertebra and bone turnover markers in rat models with glucocorticoid-induced osteoporosis.

Glucocorticoid;Fufang Zhenzhu Tiaozhi(FTZ);Bone mineral density(BMD);Biomechanics; Bone turnover markers;Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2016）01—0003—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.002?

2015-08-06)

王曉東。E-mail：wangxiaodong@163.com