梁小芹王卓常守鳳張曉玲陳城王金穗蘇勤軍

作者單位：730000 蘭州1甘肅省人民醫(yī)院病理科；730050 蘭州2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科

臨床研究

ROS1在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

梁小芹1王卓1常守鳳1張曉玲1陳城1王金穗1蘇勤軍2

作者單位：730000 蘭州1甘肅省人民醫(yī)院病理科；730050 蘭州2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科

目的探討肺腺癌組織中ROS1蛋白的表達(dá)及其臨床意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法（immunohistochemical，IHC）檢測332例肺腺癌組織和55例相應(yīng)癌旁正常肺組織中ROS1蛋白的表達(dá)，分析ROS1蛋白表達(dá)與臨床病理特征、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）和患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果ROS1蛋白在肺腺癌組織和相應(yīng)癌旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率分別為6%（20/332）和0，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ROS1蛋白陽性表達(dá)在不同年齡、性別肺腺癌患者中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與吸煙史及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），ROS1蛋白陽性組和陰性組中位無病生存期分別為19個月和42個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），1年復(fù)發(fā)率分別為30%和13.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ROS1蛋白在肺腺癌組織中低表達(dá)，ROS1對肺腺癌患者術(shù)后生存期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定影響，檢測肺腺癌患者ROS1蛋白對指導(dǎo)個體化治療有重要意義。

肺腫瘤；ROS1；免疫組織化學(xué)染色；表皮生長因子；間變性淋巴瘤激酶；預(yù)后

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中腺癌是其主要的組織學(xué)類型，大部分患者就診時已屬中晚期，治療多以放化療為主，但療效不理想。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究，以特定分子為靶點(diǎn)的靶向抗腫瘤藥物，取得了較好療效。以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變而開發(fā)的吉非替尼和厄洛替尼，以及針對間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因的蛋白激酶抑制劑克唑替尼（crizotinib）等藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，為肺腺癌患者帶來新的希望［1-2］。近年ROS1、RET、KRAS、MET、HER-2、BRAF及PI3KCA等基因相繼在肺腺癌中被報道［3］，其中ROS1融合基因是繼EGFR和ALK之后發(fā)現(xiàn)的又一治療新靶點(diǎn)，其在非小細(xì)胞肺癌中的陽性率為1%～3%［4-5］。目前研究表明，靶向藥物克唑替尼對ROS1融合基因的患者有效，因此，檢測肺腺癌患者ROS1蛋白對指導(dǎo)患者個體化治療有重要意義。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法（immunohistochemical，IHC）對332例肺腺癌組織和55例相應(yīng)癌旁肺組織中ROS1蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，分析ROS1蛋白表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集甘肅省人民醫(yī)院和蘭州軍區(qū)總醫(yī)院2007年1月至2016年1月經(jīng)病理確診為肺腺癌的332例石蠟包埋的腫瘤組織（肺腺癌組）。年齡32～77歲，中位年齡59歲，＜60歲157例，≥60歲175例；男性177例，女性155例；有明確吸煙史181例，無吸煙史151例。根據(jù)2015年WHO肺腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，其中實(shí)體型85例，腺泡型70例，乳頭型63例，貼壁型52例，微乳頭型47例，黏液腺癌15例；臨床分期采用2013年肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ期73例，Ⅱ期114例，Ⅲa期70例，Ⅲb期53例，Ⅳ期22例。以距肺腺癌組織5 cm的正常肺組織55例作為對照（正常肺組織組）。所有患者標(biāo)本采集均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。隨訪從術(shù)后病理確診為肺腺癌開始，隨訪內(nèi)容為患者腫瘤標(biāo)志物的水平及影像學(xué)資料（頭、胸部CT檢查，必要時完善骨掃描等相關(guān)檢查）。出院后每2個月隨訪1次，隨訪2年；第3年每3個月隨訪1次，之后每年隨訪2次，隨訪時間截至2016年4月1日。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人ROS1單克隆抗體（克隆號：D4D6）購自美國CST公司，兔抗人ALK單克隆抗體（克隆號：D5F3）購自瑞士羅氏公司，兔抗人EGFR受體單克隆抗體（克隆號：EP22）購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，全自動免疫組織化學(xué)染色機(jī)購自瑞士羅氏公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織芯片的制作 經(jīng)2名病理科醫(yī)生閱片并選取有代表性的腫瘤區(qū)域，手動制作儀制作組織芯片，每例取3點(diǎn)。

1.3.2 IHC 將石蠟包埋的組織制成4 μm的切片，用瑞士羅氏全自動多功能病理組織檢測系統(tǒng)進(jìn)行IHC檢測，ROSI、ALK和EGFR嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，ROSI工作濃度為1∶200，ALK和EGFR為工作液。以PBS代替一抗作陽性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 ROS1融合蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色至棕褐色為陽性，EGFR蛋白主要定位于細(xì)胞膜。按陽性強(qiáng)度和面積分別標(biāo)記為0、1+、2+、3+，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0表示腫瘤細(xì)胞無任何染色或只有細(xì)胞核著色；1+為腫瘤細(xì)胞質(zhì)呈淺棕色，且無任何背景染色；2+為腫瘤細(xì)胞質(zhì)呈棕色（<50%的腫瘤細(xì)胞著色）；3+為腫瘤細(xì)胞質(zhì)呈深棕色（>50%的腫瘤細(xì)胞著色）。

1.4.2 ALK陽性為腫瘤細(xì)胞中存在強(qiáng)顆粒狀細(xì)胞質(zhì)染色（任何百分比的陽性腫瘤細(xì)胞）。陰性為腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀細(xì)胞質(zhì)染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ROS1及ALK融合基因突變與臨床病理特征的關(guān)系用字2檢驗，用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，行l(wèi)og-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROS1蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)

332例肺腺癌組織中20例呈不同程度的ROS1蛋白陽性表達(dá)，陽性率為6%（20/332）；55例癌旁正常肺組織中，無ROS1蛋白表達(dá)（圖1A），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。20例ROS1蛋白陽性表達(dá)的病例中有2例為1+（圖1B），5例為2+（圖1C），13例為3+（圖1D）。

圖1 ROS1在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)（IHC×200）

2.2 ROS1蛋白陽性表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

20例ROS1蛋白陽性表達(dá)中男性8例，女性12例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；≤60歲患者ROS1蛋白陽性表達(dá)率為8.3%（13/157），>60歲為4%（7/175），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；無吸煙史患者的ROS1蛋白陽性表達(dá)率為9.3%（14/151），有吸煙史患者為3.3%（6/181），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。臨床分期：ROS1陽性表達(dá)I期1例、Ⅱ期5例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例，Ⅲ+Ⅳ期的陽性表達(dá)率為9.6%（14/146），Ⅰ+Ⅱ期陽性表達(dá)率為3.2%（6/186），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。組織學(xué)類型：ROS1蛋白陽性表達(dá)實(shí)性型7例、乳頭型5例、腺泡型3例、黏液腺癌3例、貼壁型2例，以實(shí)性型和乳頭型為主。

2.3 肺腺癌組織中ALK及EGFR蛋白的表達(dá)與ROS1的關(guān)系

在332例肺腺癌組織中，EGFR蛋白陽性表達(dá)116例，其中3+95例，2+13例，1+8例，1例伴有ROS1蛋白陽性表達(dá)；216例EGFR陰性表達(dá)的病例中ROS1蛋白陽性表達(dá)19例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在332例肺腺癌中ALK陽性表達(dá)28例，無ROS1蛋白表達(dá)；在304例ALK陰性表達(dá)的病例中，ROS1蛋白陽性表達(dá)20例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 ROS1蛋白陽性表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系〔n（%）〕

2.4 肺腺癌組織中ROS1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

332例患者中失訪27例，最長隨訪時間為83個月。ROS1蛋白陽性表達(dá)者中位無病生存期（diseasefree survival，DFS）為19個月，ROS1蛋白陰性表達(dá)者為42個月，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ROS1蛋白陽性表達(dá)者1年復(fù)發(fā)率為30%，明顯高于陰性表達(dá)者的13.5%（字2=4.157，P＜0.05）。

3 討論

人類ROS1基因?qū)儆冖蝾愂荏w酪氨酸激酶的胰島素受體基因，定位于人類第6號染色體q22區(qū)。ROS1受體酪氨酸激酶參與激活多條下游信號傳導(dǎo)通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及SHP2/VAV3和PLCγ/IP3，調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化及細(xì)胞周期［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)ROS1基因在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其基因重排最初在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)［7］。Rikova等［8］利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證實(shí)了肺腺癌中存在ROS1基因重排。目前的臨床資料表明，ALK抑制劑克唑替尼對治療ROS1融合基因的肺腺癌患者有明顯療效［9-10］。2016年美國食品與藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)克唑替尼作為ROS1突變型非小細(xì)胞肺癌治療用藥，ROS1成為繼EGFR和EML4-ALK后肺腺癌治療的新靶點(diǎn)。

ROS1融合基因的主要檢測方法包括熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-poly-merase chain reaction，RT-PCR）及IHC，三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。FISH技術(shù)敏感度高，特異性強(qiáng)，但操作繁瑣，耗時長。RTPCR操作簡單快速，靈敏度高，但對組織中RNA的質(zhì)量要求較高，不能檢測新的未知融合型。IHC在病理實(shí)驗室應(yīng)用普遍，成本低、簡便快速，可作為篩選ROS1陽性病例的常規(guī)技術(shù)。近期的研究表明單克隆抗體（D4D6）是一種新穎、高敏感、高特異的抗體，可以準(zhǔn)確地檢測出ROS1蛋白。Yoshida等［11］應(yīng)用D4D6單克隆抗體檢測了270例肺腺癌患者，其中17例ROS1蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)，經(jīng)FISH及RT-PCR法檢測，有15例存在ROS1基因重排，IHC檢測ROS1基因重排的敏感度及特異度高達(dá)94%和98%。此外，Kim等［12］分別采用IHC、FISH及RT-PCR法檢測肺腺癌組織中ROS1基因重排，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用D4D6抗體檢測ROS1基因重排的敏感度和特性異度均為100%。因此，本研究選用D4D6抗體檢測肺腺癌組織中ROS1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，ROS1蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示ROS1在肺腺癌的發(fā)生中起一定作用。現(xiàn)有的研究表明西方人群ROS1基因重排在肺腺癌組織中的陽性率較低，而東方或亞裔人群較高。Boyle等［13］對208例無吸煙史肺腺癌患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)ROS1基因重排陽性率為3.4%（7/208）。Chen等［14］檢測了253例肺腺癌患者，發(fā)現(xiàn)ROS1基因重排率為7.5%（19/253）。本研究ROS1蛋白陽性檢出率為6%（20/332），與上述文獻(xiàn)報道相近。本研究發(fā)現(xiàn)無吸煙史患者ROS1蛋白陽性表達(dá)14例，明顯高于有吸煙史者（6例）；臨床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者ROS1蛋白陽性表達(dá)14例，明顯高于Ⅰ+Ⅱ期。20例ROS1蛋白陽性的肺腺癌組織學(xué)類型中實(shí)體型和乳頭型共12例（60%），推測ROS1蛋白陽性多見于組織成分中實(shí)性和（或）乳頭狀成分顯著的分化差的肺腺癌。本研究表明ALK及ROS1蛋白表達(dá)陽性患者同樣具有年輕化和無吸煙史，同時組織學(xué)類型上也有一定重疊性，即以惡性度高的實(shí)性型及乳頭型較為多見，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)［15］報道一致。

以往研究表明肺腺癌組織中ROS1蛋白陽性表達(dá)往往與EGFR突變及ALK基因融合有交互關(guān)系，即ROS1蛋白表達(dá)陽性的患者一般不伴有EGFR突變和ALK基因融合，本研究332例肺腺癌組織中ALK陰性表達(dá)304例，陽性表達(dá)28例，無ROS1蛋白表達(dá)；EGFR陰性表達(dá)216例，陽性表達(dá)116例，其中在陽性表達(dá)的患者中1例有ROS1蛋白表達(dá)，Cao等［16］也有類似報道。表明ROS1蛋白表達(dá)與其他基因突變/融合共存，尤其是伴隨EGFR突變。

Cao等［16］檢測了肺腺癌組織中ROS1基因重排，觀察ROS1在肺腺癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ROS1陽性表達(dá)組預(yù)后較差，總生存期明顯縮短。本組肺腺癌患者單因素生存分析顯示，ROS1蛋白陽性表達(dá)組中位無病生存期為19個月，陰性表達(dá)組為42個月，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示ROS1與肺腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。Yan等［17］采用FISH法檢測754例非小細(xì)胞肺癌術(shù)后組織標(biāo)本的ROS1基因重排，并進(jìn)行隨訪，結(jié)果提示術(shù)后復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者ROS1蛋白表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024）。本研究中ROS1蛋白檢測結(jié)果顯示術(shù)后復(fù)發(fā)患者的表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)患者，陽性表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險更大，可能是術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測因子。

綜上所述，本研究采用D4D6單克隆抗體檢測332例肺腺癌組織中的ROS1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中ROS1蛋白陽性多見于無吸煙史及臨床分期較晚的患者，組織學(xué)類型主要以分化差的實(shí)性型及乳頭型為主，且復(fù)發(fā)率更高，提示抑制ROS1蛋白的表達(dá)或許能夠延長復(fù)發(fā)時間，提高患者總生存期。

［1］ Maemondo M，Inoue A，Kobayashi K，et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR［J］.N Engl J Med，2010，362（25）：2380-2388.

［2］ Kwak EL，Bang YJ，Camidge DR，et al.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer［J］.N Engl J Med，2010，363（18）：1693-1703.

［3］ 侯慧，高爽，任秋華，等.HER-2及LRP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國癌癥防治雜志，2013，5（4）：315-319.

［4］ Rimkunas VM，Crosby KE，Li D，et al.Analysis of receptortyrosine kinase ROS1-positive tumorsin non-smallcelllung cancer： identification of aFIG-ROS1 fusion［J］.Clin Cancer Res，2012，18（16）：4449-4457.

［5］Bergethon K，Shaw AT，Ou SH，et al.ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers［J］.Clin Oncol，2012，30（8）：863-870.

［6］Roding SJ，Mino-Kenudson M，Dacie S，et al.Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population［J］.Clin Cancer Res，2009，15（16）：5216-5223.

［7］Birchmeier C，Sharma S，Wigler M.Expression and rearrangement of the ROS1 gene in human glioblastoma cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84（24）：9270-9274.

［8］ Rikova K，Guo A，Zeng Q，et al.Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer［J］.Cell，2007，131（6）：1190-1203.

［9］ Gandhi L，J?nne PA.Crizotinib for ALK-rearranged non-small cell lung cancer：a new targeted theraphy［J］.Clin Cancer Res，2012，18（14）：3737-3742.

［10］Yasuda H，dd Figueiredo-Pontes LL，Kobayashi S，et al.Preclinical rationale for use of the clinically available multitargeted tyrosine kinase inhibitor crizotinib in ROS1-translocated lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2012，7（7）：1086-1090.

［11］Yoshida A，Tsuta K，Wakai S，et al.Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers［J］.Mod Pathol，2014，27（5）：711-720.

［12］Kim HR，Lim SM，Kim HJ，et al.The frequency and impact of ROS1 rearrangement on clinical outcomes in never smokers with lung adenocarcinoma［J］.Ann Oncol，2013，24（9）：2364-2370.

［13］Boyle TA，Masago K，Ellison KE，et al.ROS1 immunohistochemistry among major genotypes of none small cell lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2015，16（2）：106-111.

［14］Chen YF，Hsieh MS，Wu SG，et al.Efficacy of pemetrexed-based chemotherapy in patientswith ROS1 fusion-positive lung adenocarcinoma compared with in patients harboring other driver mutations in East Asian populations［J］.Thorac Oncol，2016，11（7）：1140-1152.

［15］Govindan R，Ding L，Griffith M，et al.Genomic landscape of nonsmall cell lung cancer in smokers and never-smoder［J］.Cell，2012，150（6）：1121-1134.

［16］Cao B，Wei P，Liu Z，et al.Detection of lung adenocarcinoma with ROS1 rearrangement by IHC，F(xiàn)ISH，and RT-PCR and analysis of its clinicopathologic features［J］.Onco Targets Therapy，2016，31（9）：131-138.

［17］Jin Y，Sun PL，Park SY，et al.Frequent aerogenous spread with decreased E-cadherin expression of ROS1-rearranged lung cancer predicts poor disease-free survival［J］.Lung Cancer，2015，89（3）：343-349.

［2016-08-23收稿］［2016-09-15修回］［編輯 江德吉］

ROS1 expression in pulmonary adenocarcinoma and its clinical significance

Liang Xiaoqin1，Wang Zhuo1，Chang Shoufeng1，Zhang Xiaoling1，Chen Cheng1，Wang Jinsui1，Su Qinjun2（1Department of Pathology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，P.R.China；2Department of Pathology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA，Lanzhou 730050，P.R.China）

Wang Jinsui.E-mail：lgwjs@163.com

objective To detect the expression of ROS1 protein and its potential clinical significance in patients with pulmonary adenocarcinoma.MethodsFormalin-fixed，paraffin-embedded tissue microarrays prepared from 332 patients with pulmonary adenocarcinoma and 55 samples of adjacent normal lung tissue were analyzed for ROS1 expression using immunohistochemistry. Possible relationships were analyzed between ROS1 expression and clinicopathologic features or EGFR/ALK protein expression，as well as between protein expression and postoperative recurrence.ResultsThe rate of ROS1 expression was 6%in pulmonary adenocarcinoma tissues and 0 in adjacent normal lung tissue（P＜0.05）.ROS1 expression did not correlate with age or gender，but it did correlate significantly with smoking history and clinical stage（P＜0.05）.Disease-free survival was 42 months in ROS1-negative patients and 19 months in ROS1-positive patients（P＜0.05）.Rate of recurrence at 1 year was 30%in ROS1-negative patients and 13.5%in ROS1-positive patients（P＜0.05）.ConclusionExpression of ROS1 protein is low in pulmonary adenocarcinoma.ROS1 may be a prognostic factor that predicts risk of recurrence and metastasis of lung adenocarcinoma.Screening for ROS1 expression may help guide clinical treatment.

Lung neoplasms；ROS1；Immunohistochemistry；Epidermal growth factor receptor；Anaplastic lymphoma kinase；Prognosis

R734.2

A

1674-5671（2016）06-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.06.06

甘肅省科技支撐計劃-社會發(fā)展類基金資助項目（144FKCA095）

王金穗。E-mail：lgwjs@163.com