孟曉華　尚彩娟　岳曉云　張麗梅　金秀平

【摘要】糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。轉(zhuǎn)化生長因子一β₁（TGF-β₁）是介導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展最主要的細(xì)胞因子。水飛薊素是目前廣泛應(yīng)用在肝病領(lǐng)域的天然藥物提取物，已有部分研究證實(shí)其對(duì)2型糖尿病及糖尿病腎病患者有一定的治療作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察水飛薊素對(duì)2型糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β₁的影響，探討其對(duì)2型糖尿病腎病的影響機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】水飛薊素；型糖尿病腎??；大鼠；生長因子

1材料與方法

1.1材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠45只（由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重180-220克。水飛薊素由山東健康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。兔抗大鼠TGF-β₁多克隆抗體、SP系列試劑盒購自Boster公司。鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司。

1.2動(dòng)物分組、2型糖尿病腎病模型的建立及藥物干預(yù)、標(biāo)本收集

將45只大鼠隨機(jī)分為3組（每組各15只）：對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、水飛薊素組（C組）。A組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，B組、C組參照文獻(xiàn)建立2型糖尿病腎病大鼠模型：給予高脂高糖飼料（煉豬油18%，蔗糖20%，蛋黃粉3%，常規(guī)飼料59%）喂養(yǎng)30天誘導(dǎo)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ（25mg/kg）。72小時(shí)后尾靜脈采血測隨機(jī)血糖，并留取24h尿液測24小時(shí)尿蛋白定量，以隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L，24h尿蛋白定量≥30 mg/d為2型糖尿病腎病模型造模成功。造模成功的C組在STZ注射1周后給予水飛薊素（30mg/kg∥d）灌胃，B組給予等量自來水灌胃，每日1次，共8周。灌胃第8周末，將大鼠置于代謝籠中，禁食、自由飲水，收集24h尿液備檢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血待備檢。迅速切取腎組織，去包膜后放入10%甲醛溶液固定備檢。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1腎功能及24 h尿蛋白定量測定

自動(dòng)生化分析儀測定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；免疫比濁法測定24h尿蛋白定量。

1.3.2病理學(xué)觀察

將10%甲醛固定后的腎組織常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為5μm石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理變化。

1.3.3腎組織TGF-β₁的表達(dá)

采用SP法行免疫組織化學(xué)染色半定量檢測腎組織TGF-β₁蛋白的表達(dá)。光鏡下陽性部位為棕黃色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。應(yīng)用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球和血管的不重疊的腎小管問質(zhì)區(qū)域視野，計(jì)算視野下累積光密度值（integrated optiondensity，IOD）和有效目標(biāo)分布區(qū)域的面積（area，A）。用IOD/A得到平均光密度值（mean density），作為半定量指標(biāo)用作分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組問比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腎功能及24h尿蛋白定量結(jié)果

與A組比較，B組血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較，C組的各項(xiàng)指標(biāo)均有所減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見表1）

2.2各組大鼠腎組織HE染色

光鏡下，A組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤；B組腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多，部分腎小球表現(xiàn)為結(jié)節(jié)樣硬化，部分腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡樣變性，腎間質(zhì)有明顯炎性細(xì)胞浸潤，并有局灶性纖維化；與B組比較，C組上述病變均有一定程度減輕。（見圖1-3）。

2.3各組大鼠腎組織TGF-β₁的表達(dá)

光鏡下觀察，A組腎小球系膜細(xì)胞無或有極微弱TGF-β₁表達(dá)；B組可見TGF-β₁主要表達(dá)于腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞及系膜區(qū)，其著色部位廣泛，呈棕黃色顆粒狀，腎小管上皮細(xì)胞也有不同程度表達(dá)。C組TGF-β₁表達(dá)部位與B組一致，但表達(dá)量較B組顯著下降（P<0.01）。

3討論

2型糖尿病導(dǎo)致的腎臟損害可累及腎小球、腎小管、腎間質(zhì)、腎血管等幾乎所有腎臟結(jié)構(gòu)。由于糖尿病患者機(jī)體存在極其復(fù)雜的代謝紊亂，一旦出現(xiàn)腎功能損害，其進(jìn)展速度遠(yuǎn)快于非糖尿病腎病患者，且治療更加棘手，因此尋找更加有效的防治措施，已成為當(dāng)前糖尿病學(xué)界和腎臟病學(xué)界十分急迫的課題。

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞因子參與了糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的諸多過程，轉(zhuǎn)化生長因子-β₁（TGF-β₁）是最主要的細(xì)胞因子。無論DN早期還是晚期腎組織內(nèi)TGF-β₁基因與蛋白水平均明顯增加。它的作用包括以下幾個(gè)方面：①調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。②介導(dǎo)腎臟膠原沉積，可刺激多種基質(zhì)成分和合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。③刺激細(xì)胞合成整合素，觸發(fā)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。

水飛薊素是是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取出來的植物提取物，具有對(duì)抗脂質(zhì)過氧化、抑制纖維化、促進(jìn)蛋白合成、促進(jìn)脂肪轉(zhuǎn)移等作用，目前已廣泛應(yīng)用在臨床肝病領(lǐng)域。近年的研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素對(duì)2型糖尿病及糖尿病腎病也有一定的治療作用，但其作用機(jī)制尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)采取高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗后注射小劑量STZ輕度破壞胰島B細(xì)胞，成功制備了與臨床貼近的2型糖尿病腎病模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，水飛薊素治療組大鼠腎功能受損減輕，尿蛋白排出量減少，且TGF-β₁在腎組織中的表達(dá)量明顯減少。

綜上所述，水飛薊素對(duì)2型糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制之一是通過下調(diào)TGF-β的表達(dá)。