歐陽林旗 鄧桂明 賀艷萍 肖小芹 陳鎮(zhèn) 肖望重 何海

咳喘穴位貼散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

歐陽林旗 鄧桂明 賀艷萍 肖小芹 陳鎮(zhèn) 肖望重 何海

目的 建立咳喘穴位貼散質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法鑒別制劑中的麻黃、丁香、肉桂、甘遂；采用高效液相色譜法(HPLC)法測定鹽酸麻黃堿。色譜柱為Agilent C18(4.6cm×250mm,5 μm),流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=3.4)(10∶90),流速為1.0ml/min,柱溫為25℃,檢測波長為210 nm。結(jié)果 薄層色譜圖斑點清晰,鹽酸麻黃堿在5～50 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；其平均回收率為99.89%(RSD=0.79%,n=6)。結(jié)論 本法可用于咳喘穴位貼散的質(zhì)量控制。

咳喘穴位貼散；薄層色譜法；高效液相色譜法；鹽酸麻黃堿；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

咳喘穴位貼散由麻黃、丁香、肉桂等組成。由于臨床療效明確、組方合理、深受廣大患者歡迎,是中醫(yī)藥外治法治療咳喘病標(biāo)本兼顧的特色療法。方藥中麻黃的麻黃堿為有效成分［1］,為了更好的對貼散質(zhì)量進(jìn)行控制,本研究采用HPLC測定了貼散中鹽酸麻黃堿的含量,并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司),Sartorius BP211S型電子天平,高速多功能粉碎機(jī),KDM型控溫電熱套,硅膠G板。

1.2 試劑 實驗藥材均購于湖南振興中藥飲片有限公司,經(jīng)本院張志國教授鑒定,符合《中國藥典》［2］規(guī)定。鹽酸麻黃堿對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈為色譜純試劑,水為蒸餾水,其余為分析純試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 麻黃薄層鑒別［3］取咳喘穴位貼散2 g,加濃氨水20滴,三氯甲烷10ml,加熱回流1 h,過濾,揮干濾液,殘渣加甲醇2ml充分振搖。過濾,取濾液,甲醇定容作為供試溶液。取缺麻黃的處方藥材,按照處方比例取2.0 g,同法制備缺陰性對照溶液；對照品溶液為1mg/ml的鹽酸麻黃堿甲醇溶液。按照藥典薄層色譜法操作要求,吸取上述三種試液,分別點樣于同一硅膠G薄層板上,展開劑：正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1),顯色劑：茚三酮試液。結(jié)果示在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,陰性無干擾,均為紅色斑點。見圖1A。

2.1.2 甘遂薄層鑒別［2］取咳喘穴位貼散2 g,置錐形瓶中,加乙醇30ml,超聲30min后過濾,濾液蒸干,殘渣加乙醇2ml溶解,即供試品溶液。同法制成缺甘遂陰性對照溶液。另取1.0 g甘遂對照藥材,加10ml乙醇,同法制得對照藥材溶液。吸取上述3種試液分別點樣于同一硅膠G薄層板上,展開劑：甲苯-丙酮(10:1.2),顯色劑：10%硫酸乙醇溶液,在365 nm紫外光燈下檢視,供試品色譜圖中,在與對照藥材色譜圖相應(yīng)位置上,斑點顏色相同,陰性無干擾,位置一致。見圖1B。

2.1.3 丁香薄層鑒別［2］取咳喘穴位貼散2.0 g,加石油醚(60～90℃)30ml,超聲15min后過濾,揮干濾液,殘渣加1ml甲醇溶解,即供試品溶液。同法制備缺陰性對照品溶液。另取丁香的對照藥材1.0 g,加10ml石油醚(餾程60～90℃),超聲15min后過濾,取濾液揮干,殘渣加甲醇5ml溶解,即對照藥材溶液。吸取上述三種試液,分別點樣于同一硅膠G薄層板上,展開劑：石油醚(60～90℃)-甲醇(9:1),顯色劑：5%香草醛硫酸溶液,在105℃烤箱加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,陰性無干擾,斑點顏色相同,位置一致。見圖1C。

2.1.4 肉桂薄層鑒別［2］取咳喘穴位貼散2.0 g,加乙醇20ml,超聲20min后過濾,濾液濃縮至5ml,作為供試品溶液。另取2.0 g肉桂對照藥材,同法制成對照藥材溶液。另取1.0 g缺肉桂陰性貼散,同法制備缺陰性試液,吸取上述三種試液,分別點樣于同一硅膠G薄層板上,展開劑：石油醚(餾程60～90℃)-乙酸乙酯(17:3),噴顯色劑：乙二硝基苯肼乙醇試液。365 nm紫外光燈下檢視,供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,陰性無干擾,斑點顏色相同,位置一致。見圖1D。

圖1 麻黃、甘遂、丁香、肉桂TLC譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 采用Aglient C18(254mm×4.6mm,10 μl),以甲醇為流動相A,0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=3.4)(90:10)為流動相B,檢測波長210 nm,流速1.0ml/min；柱溫25℃［1］。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸麻黃堿對照品適量,精密稱定,加甲醇制成40 μg/ml溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定貼散2.0 g,加濃氨試液20滴,再加二氯甲烷10ml,70℃回流1 h,過濾,濾液揮干后加甲醇2ml,振搖,過濾,取濾液加甲醇定容,即得。

2.2.4 缺陰性樣品溶液的制備 精密稱取按處方比例配制的缺麻黃貼散2.0 g,加濃氨試液20滴,再加二氯甲烷10ml,70℃回流1 h,過濾,濾液蒸干后加甲醇2ml充分振搖,濾過,取濾液,加甲醇定容,即得。精密吸取上述三種試液各10 μl,注入液相色譜儀,結(jié)果見圖2。

圖2 咳喘穴位貼片HPLC圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系考察 精密吸取鹽酸麻黃堿對照品溶液0.5、1、2、3、4、5ml于5ml容量瓶中,用甲醇定容,分別吸取上述溶液各10 μl,進(jìn)樣,測定,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,鹽酸麻黃堿對照品在5～50 μg內(nèi)線性關(guān)系良好,其回歸方程為：Y=4241.9X-1940.7(R2=0.9996)。

2.2.6 精密度試驗 取鹽酸麻黃堿對照品溶液10 μl,按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣6次,測定結(jié)果顯示RSD為1.03%,方法精密度符合要求。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同批次咳喘穴位貼散樣品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件測定,吸取10 μl分別于1、2、4、8、12、24 h測定,結(jié)果表明RSD為0.92%,樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同批次咳喘穴位貼散樣品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件方法,分別進(jìn)樣6次,測定結(jié)果表明：鹽酸麻黃堿平均含量為365.3 μg/g,RSD為0.96%,表明方法重現(xiàn)性好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同批樣品5份,每份2.0 g,精密量取40 μg/ml鹽酸麻黃堿1.0ml,按“2.2.3”項下方法處理,測定。見表1。

2.2.10 樣品含量測定 精密分別稱取3批樣品,按“2.2.3”項下方法制備咳喘穴位貼散樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)行測定,3個批次咳喘穴位貼散樣品溶液中鹽酸麻黃堿的含量為365.4、359.8、357.7 μg/g。見表2。

表1 加樣回收試驗

表2 樣品含量測定

3 討論

麻黃薄層色譜法鑒別中,參照藥典方法采用三氯甲烷:甲醇:濃氨水(20:5:0.5)為展開劑,樣品溶液拖尾嚴(yán)重,結(jié)果分離效果不好,現(xiàn)采用正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1)為展開劑展開,效果理想。同理,丁香也曾采用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9:1)為展開劑,結(jié)果分離效果不好,現(xiàn)采用石油醚(60～90℃)-甲醇(9:1)為展開劑,效果理想,其余均依據(jù)藥典要求。

為更好地控制制劑質(zhì)量,對其中君藥麻黃中鹽酸麻黃堿做HPLC的含量測定,測得結(jié)果表明,本方制劑中鹽酸麻黃堿的含量≥300 μg/g,方法可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好,可為該制劑的質(zhì)量評價提供合理的依據(jù)。

［1］鄧桂明,陳鎮(zhèn),楊廣民,等.超臨界CO2萃取咳喘穴位貼片藥材的工藝研究.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(11):1493-1497.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:4,8,136-137,320-321.

［3］彭飛城,丁野,鄭金鳳,等.小兒麻甘顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立.中國藥師,2012(11):1559-1561.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.11.204

2016-03-18］

湖南省中醫(yī)藥科研計劃重點項目(項目編號：201443)；湖南省教育廳重點項目(項目編號：13A067)

410007 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(歐陽林旗鄧桂明 陳鎮(zhèn) 肖望重 何海)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)(賀艷萍 肖小芹)

鄧桂明