余丹 程 輝 易 雪 張 婷

（武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北武漢430000）

·論 著·

黃芪對老年急性髓系白血病患者BCL-2家族凋亡因子的相關(guān)影響

余丹 程 輝 易 雪 張 婷

（武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北武漢430000）

目的 本研究探討黃芪（astragalus）對老年急性髓系白血病患者療效評估，并檢測其對患者Bcl-2家族凋亡相關(guān)因子的影響，從而探討黃芪對老年急性髓系白血病患者治療的作用機制。方法 隨機分配42例老年急性髓系白血病患者，分為對照組和治療組，兩組均予以化療，治療組在此基礎(chǔ)上給予黃芪，統(tǒng)計兩組病患治療后完全緩解率，患者治療后白血病細(xì)胞凋亡情況運用流式細(xì)胞儀檢驗，患者治療前后Bcl-2，Bax、Bak、BCL-xl的mRNA表達(dá)狀況運用RT-PCR方法進行檢測，統(tǒng)計兩組患者治療后療效情況。結(jié)果 治療組患者明顯優(yōu)于對照組，治療組患者完全緩解率高于對照組（P＜0.05）。治療組患者給予黃芪后，白血病細(xì)胞凋亡較對照組明顯增高，治療組治療后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak的表達(dá)較治療前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中Bcl-2、Bcl-xl較治療前明顯下降，Bax、Bak較治療前明顯升高；對照組治療后Bcl-2、Bax、Bak、BCL-xl表達(dá)水平較對治療前差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 黃芪能促進白血病細(xì)胞的凋亡，提高患者療效，其機制可能是通過減低Bcl-2、BCL-xl的表達(dá)，增加Bax、Bak的表達(dá)來完成。

急性髓系白血??；黃芪；Bcl-2；凋亡

急性髓系白血?。ˋML）是起源于造血干細(xì)胞的惡性血液系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高，診斷時中位年齡為69歲。研究顯示老年AML患者療效差，高齡尤其是70歲以上的患者，總生存率（OS）低和治療相關(guān)病死率高。老年患者臟器功能衰退，常合并心腦血管、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)疾病，大多數(shù)老年患者不能耐受化療，容易耐藥復(fù)發(fā)，治療效果差。

黃芪的主要成分黃芪多糖具有促進腫瘤細(xì)胞凋亡[1-2]的作用。數(shù)十年來多項研究表明黃芪對結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞有促進凋亡作用，但也有研究表明，黃芪可促進腫瘤細(xì)胞增殖[1-3]。Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak是重要的凋亡相關(guān)因子，參與凋亡途徑的調(diào)控，本次研究擬探討黃芪對白血病細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：初治的年齡＞60歲急性髓系白血病患者42人次，男29人次，女13人次，年齡60～81歲，平均70.5歲，2010年1月至2015年5月在武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科住院患者，以張之南教授的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》為依據(jù)，納入病例，進行病例篩選，并排除急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，本次臨床研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者需簽署知情同意書。AML中有7例M1型，12例M2型，10例M4型，9例M5型，2例M6型，并將老年髓系白血病患者隨機分為兩組，每組各21例，給予CAG、DAG、HAG等預(yù)激方案治療，第一次完全緩解期老年AML患者緩解后的鞏固治療多采用1～2個周期的降低劑量的改良的大劑量阿糖胞苷或重復(fù)傳統(tǒng)化療方案（CAG、DAG、HAG等預(yù)激方案治療），治療組患者每次化療開始時給予黃芪顆粒30g/d，水沖服至化療后患者骨髓恢復(fù)，并在化療前及化療后骨髓恢復(fù)后抽取患者骨髓進行分析。

1.2 試驗材料與方法：黃芪顆粒，批號1510004W，10g/袋，華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供。FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自碧迪有限公司。PCR：TRIzol購自Invitrogen公司，DMSO購自美國Sigma公司。

流式分選儀檢測兩組患者白血病細(xì)胞凋亡情況。收集患者開始治療前、后骨髓液。取樣品100 μL與單抗20 μL混勻后，室溫遮光孵育15 min，加入溶血劑混勻，避光10 min，加入PBS洗滌，離心，棄去上清液，即可上機檢測白血病細(xì)胞的凋亡率。

兩組患者治療前后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak等凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況通過RT-PCR檢測。收集兩組AML患者治療前后骨髓細(xì)胞，取肝素（107u/L）抗凝骨髓液4 mL，提取單個核細(xì)胞。用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物及參照物引物見表1，提取RNA時使用TRIzol試劑，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR的反應(yīng)模板。凋亡相關(guān)基因引物如表1，上海英俊生物技術(shù)有限公司協(xié)助合成引物。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 mg/L的溴化乙錠）（78 v，30 min）后，紫外透射儀觀下察結(jié)果，以Gene tools軟件對電泳條帶進行灰度掃描，以各個基因與β-actin電泳帶的灰度值的比值（ODR）代表各個基因mRNA的表達(dá)水平。以目的基因灰度值與同一樣本的β-actin的灰度值的比值作為統(tǒng)計參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析和t檢驗，各基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 凋亡相關(guān)基因引物序列、退火溫度及反應(yīng)產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

治療組患者完全緩解率為57%，對照組為37%，治療組1名患者因心功能不全未完成化療，對照組有2名患者分別因為重癥肺炎及心功能衰竭未完成化療。比較兩組完全緩解率，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

兩組患者治療前后白血病細(xì)胞凋亡情況：通過流式細(xì)胞儀檢測兩組患者治療前及治療后第28 d后的骨髓液中白血病細(xì)胞，計算其凋亡比例其平均值，治療組骨髓中白血病細(xì)胞受抑率（70.63± 3.17）%為較對照組（52.54±2.98）%明顯增高，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

通過RT-PCR方法檢測兩組患者治療前后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak的mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示治療組20例AML患者有18例表達(dá)Bcl-2（陽性率85.71%），對照組20例中17例表達(dá)，兩組治療前表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療組治療后Bcl-2、Bal-xl mRNA表達(dá)量較治療前明顯下降（P＜0.05），治療組治療后Bax、Bak mRNA表達(dá)量較治療前明顯上升（P＜0.05）。而對照組治療后Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xl mRNA表達(dá)量較治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表達(dá)量比較應(yīng)用t檢驗，見表2。

3 討論

急性髓系白血病發(fā)病率高，每年發(fā)病率為3.6/ 10萬，老年患者居多，對化療耐受差，治療較為棘手。黃芪中的主要成分黃芪多糖具有治療實體腫瘤的作用，但未見其對老年急性髓系白血病療效的報道。本文將黃芪聯(lián)合化療治療老年AML，加用黃芪組患者完全緩解率及白血病細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)。黃芪有助于提老年急性髓系白血病的療效，而其作用機制尚待研究[4-5]。

表2 Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xl在治療組和對照組治療前后mRNA表達(dá)情況

Bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的基因[6]。染色體異位t（14，18）（q31，q21）斷裂點處發(fā)現(xiàn)的B cell lyphoma/leukemia 2，即Bcl-2基因在14號染色體上受IgH啟動子、增強子控制，導(dǎo)致過度表達(dá)。在某些腫瘤組織中高表達(dá)Bcl-2基因，可促進細(xì)胞抵抗外界環(huán)境刺激和壓力，阻止程序化死亡[7]。在初診的AML中，Bcl-2基因陽性率各家報道不一，78.6%～100%[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)與文獻相似，AML病人的細(xì)胞中有Bcl-2基因的高表達(dá)達(dá)85.71%，進一步證實了Bcl-2基因的紊亂在AML的發(fā)病中起重要作用。Bcl-2家族成員眾多，根據(jù)功能不同分為抑制凋亡基因和促進凋亡的基因。Bcl-xl是Bcl-x基因通過mRNA剪切形成的蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-xl、Bax、Bcl-2三者形成一個凋亡調(diào)控體系。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，從而促進細(xì)胞凋亡；Bcl-2中的BH1或BH2區(qū)域特定氨基酸置換后，能形成同源二聚體后，Bax不能與Bcl-2形成二聚體，喪失促進凋亡的功能。Bax基因失活導(dǎo)致腫瘤迅速生長，表明Bax基因也許是一個腫瘤抑制基因。Bax較易于Bcl-2結(jié)合，形成異源二聚體，比Bax/Bax同源二聚體穩(wěn)定性好，而當(dāng)細(xì)胞Bcl2降低時，Bcl-2/Bax二聚體下降，Bax/Bax就較易形成，促進Bax的凋亡作用。假如有Bcl-xs存在時，優(yōu)先與Bcl-2結(jié)合，使得Bax/Bax同源二聚體比例增加，促進細(xì)胞凋亡。Bak結(jié)構(gòu)與Bcl-2相似，能與Bcl-xl形成異源二聚體，其BH3結(jié)構(gòu)域通過抑制Bcl-2和Bcl-xl，促進細(xì)胞凋亡。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖治療老年急性髓系白血病后患者體內(nèi)Bcl-2、Bcl-XL較治療前明顯下降Bax、Bak較治療前明顯上升。而對照組中雖有所改變，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，綜合本研究黃芪可能是通過對Bcl-2家族的作用通路促進白血病細(xì)胞凋亡。黃芪促進白血病細(xì)胞凋亡，改善老年AML患者療效，為攻克老年AML提供新的思路，而其可能是通過Bcl-2家族凋亡因子而發(fā)揮作用，而其是否存在其他作用途徑有待進一步研究。

［1］ 許杜娟，陳敏珠.黃芪總提物抗腫瘤作用及其機制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（12）：771-772.

［2］ 陳光，臧文臣，劉顯清，等.黃芪多糖對動物腫瘤細(xì)胞凋亡影響的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2002，30（4）：55.

［3］ Tin MM，Cho CH，Chan K，et al.Astragalus saponins induce growBth inhibition and appotosis in human colon cancer cells and tumorxenograft［J］.Carcinogenesis，2007，28（6）：1347-1355.

［4］ 崔澂，呂克藺，劉秀萍，等．黃芪注射液體外促進宮頸癌細(xì)胞增殖及其調(diào)控分子表達(dá)分析［J］．中藥藥理與臨床，2014，30（6）：105-108．

［5］ 谷俊朝，余微波，王宇，等.黃芪多糖對TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生長及HSP70表達(dá)的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13（20）：1534-1537.

［6］ Osorio LM，Jondal M.Aguiiar-Santelises M.Regulation of B -CLL apoptosis through membra ne receptors and Bcl-2 familyproteins［J］.LeukemiaandLymphoma，1998，30：247-256.

［7］ Kwan Chang Kim MD，Jae Chul Lee PhD，Hyeryon Lee MS，et al.Changes in Caspase-3，B Cell Leukemia/Lymphoma-2，Interleukin-6，Tumor Necrosis Factor-α and Vascular Endothelial Growth Factor Gene Expression after Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells Transfusion in Pulmonary Hypertension Rat Models［J］.Korean Circ J，2016，46（1）：79-92.

［8］ Nguyen JC，Kubik MJ，Broome HE，et al.Successful treatment of both double minute of C-MYC and BCL-2 rearrangement containing large B-cell lymphoma with subsequent unfortunate development of therapy-related acute myeloid leukemia with t（3;3）（q26.2;q21）［J］.Pathol Res Pract，2015，211（11）：883-891.

［9］ Sahu G1，Jena RK.Clinical significance of P53 and Bcl-2 in acute myeloid leukemia patients of Eastern India［J］.Hematol Rep，2011，19;3（3）：91-94.

［10］Wang M1，Wang LR，Cui JY，et al.Expression and clinical significance of B-cell lymphoma 2（BCL-2）in hyperleukocytic acute myeloid leukemia［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2013，21（4）：851-856.

The Influence of Astragalus on Apoptosis Related Factors Bcl-2’s Famlily in Eld Patients with Acute Myeloid Leukemia

Yu Dan Cheng HuiYi Xue Zhang Ting
（Wuhan First Hospital Blood Internal Medicine，Wuhan 430000，China）

ObjectiveIn order to disscuss the underlying treatment mechanism of astragalus on eld patients with acute myeloid leukemia，this study was purposed to investigate the efficacy of astragalus in the treatment of eldly patients with acute myeloid leukemia and the influence of astragalus on atopsoptosis（apoptosis related factors）Bcl-2’s famlily in the patients.Method There were 42 eld patients with AML divided into the treatment and the control groups randomly.Both of the groups were treated with chemotherapy and the treatment group received astragalus more.The rates of complete remission were analysed，the apoptosis of leukemia cells was quantitatively examined by FCM，the expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak mRNA were detected by Realtime-PCR before and after therapy，The effectiveness of the two groups would be observed after treatment.ResultThe complete remission rate of the treatment group was statistically higher than the control one（P＜0.05）.The apoptosis rates of leukemia cells in the treatment group after the therapy were significantly higher than the control group.The mRNA expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak were especially different from the expressions before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The expressions of Bcl-2 and Bcl-xl were notably lower than before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The Bax and the Bak mRNA expressions were especially higher than before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The mRNA expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak had no significant difference from the expressions before therapy in the control group（P＜0.05）.ConclusionAstragalus could promote the process of apoptosis for the leukemia cell and improve the patient’s treatment effect.The mechanism of these may be related to the increases of the apotosis for leukemia cells by reducing the expressions of Bcl-2 and Bcl-xl and promoting the expressions of Bax、Bak.

Acute myeloid leukemia；Astragalus；Bcl-2；Atopsoptosis

R73-34

A 學(xué)科分類代碼： 32024

1001-8131（2016）05-0501-03

2016－06－30

武漢市科技局課題＜AML白血病干細(xì)胞表觀遺傳學(xué)改變的研究初探＞（201161038341-02）