張　麗，張利宣，張素華，王　靜，丁　芳(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院干部病房，河北 石家莊 050051)

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·論著·

LMNA基因C.1583 C>G突變致Emery-Dreifuss型肌營(yíng)養(yǎng)不良2個(gè)家系心臟受累特點(diǎn)研究

張麗，張利宣*，張素華，王靜，丁芳(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院干部病房，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的分析LMNA基因C.1583 C>G突變致2個(gè)Emery-Dreifuss型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，EDMD)家系心臟受累特點(diǎn)。方法收集、分析2例先證者及其家系臨床資料及血液標(biāo)本(提取DNA)，以及2例先證者活組織檢查骨骼肌病理分析；PCR、直接測(cè)序；3例患者進(jìn)行心電圖、超聲心動(dòng)圖、99TcM-MIBI門控心肌灌注顯像檢查。結(jié)果家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發(fā)病例；3例患者均具有典型的EDMD臨床表現(xiàn)：關(guān)節(jié)攣縮，進(jìn)行性加重肌無力、肌萎縮，心律失常伴或不伴心肌病；活組織檢查骨骼肌病理分析呈肌病改變；基因檢測(cè)家系1(2例患者)、家系2(1例患者)LMNA基因9號(hào)外顯子C.1583C>G(T528R)雜合錯(cuò)義突變；心電圖及心臟影像學(xué)檢查顯示3例患者表現(xiàn)不同程度及類型的心律失常：竇性心動(dòng)過速、心房撲動(dòng)、Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯；家系2先證者合并心肌病，家系1先證者合并擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭；家系1先證者女兒無明顯心臟結(jié)構(gòu)功能異常。結(jié)論2個(gè)家系3例患者經(jīng)臨床、活組織檢查骨骼肌病理分析、基因檢測(cè)確診為EDMD，致病基因均為L(zhǎng)MNA基因9號(hào)外顯子C.1583C>G(T528R)雜合錯(cuò)義突變；LMNA基因突變所致EDMD心臟受累程度更嚴(yán)重，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)受累常合并擴(kuò)張型心肌病和(或)心力衰竭。

[關(guān)鍵詞]肌營(yíng)養(yǎng)不良,Emery-Dreifuss型；心臟?。煌蛔?/p>

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.01.002

Emery-Dreifuss型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，EDMD)是一組進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良，臨床表現(xiàn)為早期關(guān)節(jié)攣縮、進(jìn)行性加重的肌無力和肌萎縮、心臟受累三聯(lián)征(包括X連鎖遺傳、常染色體顯性遺傳及常染色體隱性遺傳3種遺傳方式)[1]。心臟受累是EDMD患者猝死的首要原因，關(guān)注EDMD患者的心臟受累，早診斷，早治療，定期隨訪，能夠延長(zhǎng)患者壽命，改善患者的生存質(zhì)量[2]。常染色體遺傳最常見的致病基因?yàn)長(zhǎng)MNA基因[3]，該基因突變所致常染色體顯性遺傳EDMD(autosomal dominant EDMD，AD-EDMD)，心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴(yán)重，而目前對(duì)LMNA基因突變所致EDMD心臟受累報(bào)道較少。本研究報(bào)道分析了攜帶LMNA基因錯(cuò)義突變的2個(gè)EDMD家系心臟受累特點(diǎn)。

1資料與方法

1.1一般資料收集2006年10月—2013年9月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)肌肉病科家系1先證者、家系1先證者女兒和家系2先證者(3例患者)以及所屬2個(gè)家系的臨床資料，進(jìn)行詳細(xì)的家系調(diào)查。

本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2活組織檢查骨骼肌病理分析局部浸潤(rùn)麻醉下，行開放式左肱二頭肌活組織檢查，快速異戊烷/液氮冷凍，-80 ℃保存，恒冷切片機(jī)7 μm切片，組織化學(xué)及抗Emerin、LaminA/C單克隆抗體免疫熒光染色，病理分析。

1.3心臟評(píng)估常規(guī)進(jìn)行12導(dǎo)聯(lián)心電圖(electrocardiogram，ECG)、經(jīng)胸二維超聲心動(dòng)圖檢查(ultrasonic cardiogram，UCG)及99TcM-MIBI門控心肌灌注顯像(99TcM-MIBI gated myocardial perfusion imaging,99TcM-MIBI GPI)。

1.4基因分析

1.4.1DNA標(biāo)本獲得3例患者及家系成員采集靜脈血3 mL，天根試劑盒提取全血DNA，-20 ℃保存，用于基因分析。

1.4.2引物設(shè)計(jì)參照人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Genebank 提供的LMNA基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，覆蓋LMNA基因全長(zhǎng)，分別包括12個(gè)外顯子及內(nèi)含子交界區(qū)。

1.4.3LMNA基因PCR50μL，高壓雙蒸水32 μL,10×緩沖液5 μL，dNTP(100 mg/L)4 μL，Takara Hotstar Taq PCR 反應(yīng)目的片段擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物分離鑒定，PCR 產(chǎn)物純化ABI-377自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，應(yīng)用Sequencher 4.90 軟件測(cè)序結(jié)果與LMNA正常人類基因組參照序列進(jìn)行比對(duì)分析,家系成員重復(fù)相關(guān)突變基因位點(diǎn)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1臨床特點(diǎn)家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發(fā)病例。家系1先證者女兒血肌酸激酶(creatine kinase CK)輕度升高，其余患者血CK檢查結(jié)果正常。3例患者肌電圖檢查均提示肌源性改變。臨床資料見表1，家譜圖見圖1。

表1　2個(gè)EDMD家系3例患者臨床資料

圖1家譜圖

A.家系1：箭頭指示的是先證者，黑色符號(hào)表示患者，白色符號(hào)代表健康個(gè)體；B.家系2：箭頭指示的是先證者，黑色符號(hào)表示患者，白色符號(hào)代表健康個(gè)體

Figrure 1Pedigree of two families examined in the study

2.2活組織檢查骨骼肌病理HE染色示肌纖維大小不一，變性、壞死和再生肌纖維散在，可見輕度核內(nèi)移及肌纖維分裂，結(jié)締組織增生；COX染色部分肌纖維酶活性缺失或減低；ATP染色(pH=4.65)，選擇性Ⅱ型肌纖維優(yōu)勢(shì)(家系1先證者)，選擇性Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢(shì)(家系1先證者女兒、家系2先證者)；萎縮肌纖維有成小群趨勢(shì)；抗Emerin、laminA/C免疫熒光染色正常(圖2)。

圖2活組織檢查骨骼肌病理分析

A.呈散在肌纖維變性，壞死，再生，結(jié)締組織增生(HE ×100)；B.Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢(shì)(ATP染色 ×100)；C.肌纖維核膜抗Emerin單克隆抗體正常著色(免疫熒光染色 ×100)；D.肌纖維核膜抗Lamin A/C單克隆抗體正常著色(免疫熒光染色 ×100)

Figrure 2Representative histopathological analysis of muscle biopsies from patient 1 with Emery-Dreifuss muscular dystrophy

2.3心臟評(píng)估家系1先證者，出現(xiàn)心悸、胸悶、呼吸困難，心肺查體：叩診心界向左下擴(kuò)大，心率 42次/min，節(jié)律規(guī)整，余未見明顯陽(yáng)性體征；家系1先證者女兒，無心臟受累的臨床癥狀和體征；家系2先證者，出現(xiàn)心悸、一過性黑矇臨床表現(xiàn)，心肺查體：心率 58次/min，節(jié)律不整，余無明顯異常體征。

2.3.1ECG檢查家系1先證者：Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯，室性逸搏；家系1先證者女兒：竇性心動(dòng)過速；家系2先證者：心房撲動(dòng)、P′波與QRS波動(dòng)比例2~4∶1下傳(圖3)。

2.3.2心臟影像學(xué)檢查家系1先證者：UCG示全心增大、二三尖瓣少量反流、左心室舒張功能減低，左心室射血分?jǐn)?shù)減低(45%)；99TcM-MIBI GPI示左心室腔增大，左心室壁心肌呈“花斑樣”改變。家系1先證者女兒：UCG及99TcM-MIBI GPI未見異常。家系2先證者：UCG檢查未見明顯異常，99TcM-MIBI GPI示左心室前壁中段血流灌注減低(圖3)。

圖3 患者1、2、3ECG、99TcM-MIBIGPI表現(xiàn)A.患者1ECG表現(xiàn)為完全性房室傳導(dǎo)阻滯;B.患者2ECG表現(xiàn)為竇性心動(dòng)過速;C.患者3ECG表現(xiàn)為心房撲動(dòng);D.患者199TcM-MIBIGPI顯示左心室心肌花斑樣改變;E.患者299TcM-MIBIGPI顯示正常;F.患者399TcM-MIBIGPI顯示左心室心尖部心肌灌注減低Figure3 ECG,99TcM-MIBIGPItracesofpatients1,2and3

2.4基因檢測(cè)家系1先證者及其女兒基因檢測(cè)結(jié)果：LMNA基因9號(hào)外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯(cuò)義突變，家系中其他7人無該突變位點(diǎn)。家系2先證者基因檢測(cè)結(jié)果：LMNA基因9號(hào)外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯(cuò)義突變，家系中其他5人無該突變位點(diǎn)(圖4)。

圖4LMNA基因測(cè)序圖：LMNA基因9號(hào)外顯子C.1583 C>G(T528R)突變

Figure 4Chromatograms of the heterozygous C.1583 C>G(T528R) mutation in exon 9 ofLMNA

3討論

LMNA基因定位于染色體1q21，由12個(gè)外顯子組成，由于剪接部位的不同，可轉(zhuǎn)錄為2種不同的mRNA，分別編碼相對(duì)分子質(zhì)量為74 000的LaminA和64 000的LaminC[3]。LaminA/C是V型中間絲蛋白家族成員(中部由7個(gè)重復(fù)的疏水氨基酸序列組成α-螺旋桿狀區(qū)域,兩端由球狀的氨基端和羧基端組成)，位于細(xì)胞核纖層內(nèi)，廣泛表達(dá)于骨骼肌、心肌、脂肪、血管、皮膚、神經(jīng)組織，具有多種功能，包括調(diào)控細(xì)胞核的生長(zhǎng)和形狀、DNA復(fù)制、染色質(zhì)形成、RNA剪切、細(xì)胞分化、凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[4]。

本研究結(jié)果顯示，家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發(fā)病例，2個(gè)家系的先證者及患者符合EDMD的典型臨床特征：早期肩、肘、踝關(guān)節(jié)攣縮；緩慢進(jìn)展的肌無力和肌萎縮呈肱-腓分布,隨病情進(jìn)展,逐漸擴(kuò)展到腰帶肌、脊柱旁肌。3例患者活組織檢查骨骼肌組織化學(xué)染色可見少量變性、壞死和再生肌纖維，結(jié)締組織增生，提示肌營(yíng)養(yǎng)不良改變；Emerin及LaminA/C單克隆抗體免疫熒光染色均正常。EDMD活組織檢查骨骼肌病理像缺乏特異性，因此不能作為確診依據(jù)，EDMD的明確診斷需基因分析。

本研究基因檢測(cè)家系1先證者及其女兒、家系2先證者LMNA基因9號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)同一C.1583 C>G雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第528個(gè)氨基酸由蘇氨酸替換為精氨酸(T528R)，該基因變異與意大利和德國(guó)學(xué)者的報(bào)道一致[5-6]，提示該突變可能無種族差異，且有較高的發(fā)生率。有學(xué)者報(bào)道AD-EDMD患者新生突變(散發(fā)病例)發(fā)生率較高，約為76%[7]，家系2中僅先證者出現(xiàn)了LMNA基因突變，提示該患者為新生突變致病。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)受累為EDMD患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其受累程度與骨骼肌無力的嚴(yán)重程度無相關(guān)性，與年齡及病程呈正相關(guān)[8]。心律失常的特征性表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的竇房結(jié)功能減低和(或)房室傳導(dǎo)阻滯；發(fā)病率最高的是心房顫動(dòng)、心房撲動(dòng)等室上性快速性心律失常，伴或不伴有束支阻滯；其次為房室傳導(dǎo)阻滯；部分患者可出現(xiàn)室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等惡性心律失常，是患者猝死的首要原因[8]。本研究患者出現(xiàn)了不同程度及類型的心律失常，與年齡呈正相關(guān)：家系1先證者女兒(12歲)，年齡最小，心臟受累程度最輕，僅表現(xiàn)為竇性心動(dòng)過速；家系2先證者(24歲)，表現(xiàn)為心房撲動(dòng)，提示竇房結(jié)功能減退；家系1先證者(33歲)，心臟受累程度最重，出現(xiàn)房室傳導(dǎo)阻滯及室性逸搏，提示傳導(dǎo)系統(tǒng)嚴(yán)重受損。

LMNA基因突變所致AD-EDMD心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴(yán)重，除傳導(dǎo)系統(tǒng)受累外，常伴有擴(kuò)張型心肌病、左心室功能減退或心力衰竭，活組織檢查心肌病理分析可見大量心肌細(xì)胞變性、壞死、顯著心肌纖維化和脂肪浸潤(rùn)[8-9]。心臟影像學(xué)檢查(UCG及99TcM-MIBI GPI)：家系2先證者左心室前壁中段血流灌注減低，提示合并心肌??；家系1先證者心腔擴(kuò)大，左心室舒縮功能減低，左心室壁心肌灌注嚴(yán)重缺損，提示合并擴(kuò)張型心肌病及心力

衰竭；家系1先證者女兒心臟瓣膜結(jié)構(gòu)及功能未見明顯異常，心臟受累程度較輕，考慮與年齡較小、病程較短有關(guān)，需進(jìn)一步隨訪觀察病情變化。LMNA基因突變影響LaminA/C蛋白中央“桿”狀功能區(qū)，為擴(kuò)張型心肌病的主要發(fā)病機(jī)制。本研究中，第528位蘇氨酸位于氨基酸序列球形尾部區(qū)域高度保守的序列，該氨基酸突變對(duì)蛋白中央“桿”狀功能區(qū)影響不大，通過引起球狀功能區(qū)正常結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致蛋白LaminA/C穩(wěn)定性降低[10]。最近有研究報(bào)道了R541H突變所致EDMD心臟受累表型嚴(yán)重，猝死發(fā)生率高，兒童期即需要心臟移植。蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)R541H突變主要影響LaminA/C蛋白兩端球狀功能區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致較嚴(yán)重的心臟臨床表型[3]。本研究研究結(jié)果與之一致[11-12]。

本研究2個(gè)家系3例患者經(jīng)臨床、活組織檢查骨骼肌病理分析、基因檢測(cè)確診為EDMD，致病基因均為L(zhǎng)MNA基因9號(hào)外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯(cuò)義突變；LMNA基因突變所致EDMD心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴(yán)重，常合并擴(kuò)張型心肌病和(或)心力衰竭，心臟受累與年齡及病程呈正相關(guān)。

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(本文編輯：趙麗潔)

Cardiac effects of the C.1583 C>GLMNAmutation in two families

with Emery-Dreifuss muscular dystrophy

ZHANG Li，ZHANG Li-xuan*，ZHANG Su-hua，WANG Jing，DING Fang

(Department of Geriatric Diseases，the Third Hospital of Hebei Medical

University，Shijiazhuang 050051，China)

[Abstract]ObjectiveTo report and analyze cardiac involvement in two Emery-Dreifuss muscular dystrophy(EDMD) pedigrees caused by C.1583 C>G mutation of the lamin A/C gene(LMNA).MethodsThe characteristics of members of two families with EDMD were evaluated clinically,pathologically and genetically.Skeletal muscle biopsies and pathological analysis were performed in two probands.Electrocardiogram,ultrasound cardiography and99TcM-MIBI-gated myocardiac perfusion imaging(99TcM-MIBI GPI) were performed on three patients.ResultsFamily history investigations revealed an autosomal dominant transmission pattern of disease in family 1,and a sporadic case in family 2.Three affected patients all presented typical clinical features of EDMD including joint contracture,muscle weakness,and cardiac involvement.Muscle histopathological study revealed dystrophic features.Moreover,each affected individual presented with cardiac arrhythmia,evident as sinus tachycardia,atrial flutter,or complete atrioventricular block.Cardiac imaging study showed dilated cardiomyopathy in two patients,one of whom was undergoing heart failure,the second patient had no obvious abnormalities in cardiac structure or function.All three affected individuals had a heterozygous missense mutation inLMNAgene(C.1583 C>G) ,which caused a T528R amino acid change inLMNAprotein.ConclusionThree patients were identified with EDMD,clinically,pathologically and genetically.Causative gene was missense mutation C.1583 C>G ofLMNA.EDMD caused by mutation ofLMNApresented more severe cardiac involvement,complicated with cardiac conduction system defect,cardiomyopathy and/or heart failure.

[Key words]muscular dystrophy,Emery-Dreifuss；heart diseases；mutation

[中圖分類號(hào)]R746.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)01-0005-05

*通訊作者

[作者簡(jiǎn)介]張麗(1981-)，女，河北衡水人，河北醫(yī)科大學(xué)第三

[基金項(xiàng)目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20150274)

[收稿日期]2015-08-17；[修回日期]2015-09-15

醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事老年病及遺傳病診治研究。