魏曉曉，杭柏林，馬　翠，夏一赫，張冰清，王　青，徐彥召，胡建和

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

?

抗菌肽JH-3的抑菌活性及其穩(wěn)定性分析

魏曉曉，杭柏林*，馬翠，夏一赫，張冰清，王青，徐彥召，胡建和*

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

摘要：對(duì)牛血紅蛋白源抗菌肽P3進(jìn)行氨基酸改造，并了解改造后抗菌肽JH-3的抑菌活性和穩(wěn)定性。通過(guò)微量稀釋法檢測(cè)了抗菌肽JH-3的最小抑菌濃度(MIC)，通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察了細(xì)菌和真菌形態(tài)的變化，測(cè)定了抗菌肽JH-3的溶血性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和鹽穩(wěn)定性。結(jié)果表明：抗菌肽JH-3對(duì)革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌2型)的MIC為6.25～25 μg·mL-1，對(duì)革蘭陰性菌(大腸桿菌、豬霍亂沙門(mén)菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌)的MIC為3.125～50 μg·mL-1，對(duì)真菌(白色念珠菌)的MIC為12.5 μg·mL-1，均具有良好的抗菌活性。經(jīng)抗菌肽JH-3處理后，大腸桿菌細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮、孔洞；金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌體皺縮，細(xì)胞的完整性受到破壞；白色念珠菌細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷、突出、裂痕。在 6～100倍MIC時(shí)312.5 μg·mL-1抗菌肽JH-3的溶血率僅12.84%；75～100 ℃的高溫、80～100 mmol·L-1的高濃度NaCl和pH 4.0及pH 10.0的高酸堿性對(duì)抗菌肽JH-3的抑菌活性沒(méi)有明顯的影響。研究結(jié)果為抗菌肽JH-3的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，且抗菌肽JH-3有替代抗生素成為新抗菌藥物的潛力。

關(guān)鍵詞：抗菌肽JH-3；抑菌活性；溶血性；穩(wěn)定性

自弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素后，抗生素對(duì)人類(lèi)的貢獻(xiàn)居功甚偉。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，一些負(fù)面問(wèn)題日益突出?？股氐拇罅渴褂煤蜑E用導(dǎo)致了耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VER)[2]等，使得臨床疾病的治療愈發(fā)困難。同時(shí)藥物殘留對(duì)人類(lèi)的健康威脅也愈發(fā)嚴(yán)重[3]。有效且安全的新抗生素研發(fā)成功往往滯后于耐藥性菌株的出現(xiàn)。許多國(guó)家已禁止在動(dòng)物飼料中應(yīng)用抗生素[4-5]。因此，選擇抗生素替代物成為必然選擇。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[6]，參與機(jī)體的第一道防線(xiàn)，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性[7-8]。與抗生素相比，抗菌肽的抗菌機(jī)制獨(dú)特、不易誘發(fā)耐藥性、安全度較高[9-10]，因此，抗菌肽是抗生素的理想替代品[11]。

目前，通過(guò)不同方法獲得的抗菌肽已達(dá)2 500多種[12]。但是，許多抗菌肽存在抑菌活性不強(qiáng)、溶血性、細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)。因此，提高抗菌肽抑菌活性、降低其對(duì)機(jī)體毒性是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。P3是一株牛紅細(xì)胞血紅蛋白源抗菌肽，具有一定的抗菌活性[13-14]。但是，人工合成P3的抗菌活性低。對(duì)已有抗菌肽的氨基酸序列進(jìn)行改造是提高抗菌肽抗菌活性的一條有效途徑。因此，本研究對(duì)P3的氨基酸進(jìn)行了分析，設(shè)計(jì)了一條P3類(lèi)似多肽JH-3，通過(guò)MIC測(cè)定、SEM(掃描電鏡觀(guān)察)對(duì)JH-3的抑菌活性及其穩(wěn)定性和溶血性等進(jìn)行了綜合分析，以期為JH-3的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1抗菌肽抗菌肽JH-3由上海吉爾生化有限公司采用固相法合成，電噴射質(zhì)譜鑒定，反相高效液相色譜純化，純度>97%。1.1.2試驗(yàn)菌株和試劑大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、白色念珠菌(ATCC90029)等菌株均購(gòu)自ATCC，沙門(mén)菌(CVCC503)、鏈球菌2型(CVCC606)、副豬嗜血桿菌(CVCC3728)、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(CVCC268)等菌株均購(gòu)自CVCC。TSB(Tryptic Soy Broth，Solarbio公司)，胎牛血清(Gibco公司)，氨芐青霉素(Solarbio公司)，制霉菌素(Solarbio公司)，胰蛋白胨(Oxoid公司)，酵母提取物(Oxoid公司)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3實(shí)驗(yàn)器材打孔器(?為3 mm，北京普波斯生物有限公司)，高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)，生物安全柜(美國(guó)Thermo Scientific公司)，37 ℃培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1理化特性的預(yù)測(cè)通過(guò)抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)APD(http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)對(duì)JH-3和P3的氨基酸序列進(jìn)行理化特性預(yù)測(cè)。進(jìn)入網(wǎng)站后選擇“Calculation & Prediction”，在方框中輸入抗菌肽序列，點(diǎn)擊“submit”，會(huì)得到相對(duì)分子質(zhì)量、總電荷數(shù)和疏水率等數(shù)據(jù)。

1.2.2抑菌活性的測(cè)定根據(jù)微量稀釋法[15]測(cè)定抗菌肽抑菌活性。挑取細(xì)菌分別接種于TSB培養(yǎng)基(pH 7.2)或含5%胎牛血清的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH 7.2)中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再進(jìn)行新鮮培養(yǎng)3 h，于4 ℃、4 000 r·min-1的條件下離心10 min，棄去上清，用PBS懸浮細(xì)菌，離心，棄上清，再用磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)懸浮細(xì)菌，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.0×106CFU·mL-1，取50 μL加入96孔板中，然后分別加入用滅菌水稀釋的200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 μg·mL-1的抗菌肽50 μL，37 ℃作用24 h，肉眼觀(guān)察菌液澄清度，菌液渾濁表明有菌生長(zhǎng)，渾濁和澄清分界處的抗菌肽濃度即為MIC。每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。

1.2.3電鏡觀(guān)察分別調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的濃度為1.0×106CFU·mL-1，以加入MIC濃度的抗菌肽為試驗(yàn)組，以不加抗菌肽的菌液為對(duì)照組；37 ℃作用30 min；然后按照掃描電鏡樣品制備方法進(jìn)行處理菌液，送新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)室觀(guān)察菌體形態(tài)變化。

1.2.4溶血性的測(cè)定按照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行溶血性的測(cè)定。通過(guò)耳緣靜脈以無(wú)菌操作采集新西蘭兔血液，用肝素進(jìn)行抗凝?？鼓?jīng)1 000×g離心5 min，棄去上清液，沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，再用PBS稀釋?zhuān)⒄{(diào)整紅細(xì)胞濃度為1%(體積百分?jǐn)?shù))。稀釋抗菌肽，使其濃度分別為312.5、31.25和3.125 μg·mL-1，然后等體積加入紅細(xì)胞懸液，以PBS為陰性對(duì)照，1%(體積百分?jǐn)?shù))Tritonx-100為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃作用1 h，1 000×g離心5 min，取上清液，依次加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(波長(zhǎng)540 nm)，根據(jù)OD值來(lái)計(jì)算溶血率。溶血率(%)=(試驗(yàn)組OD值-陰性對(duì)照OD值)/(陽(yáng)性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值)×100%。

1.2.5穩(wěn)定性分析以大腸桿菌為試驗(yàn)菌株，通過(guò)瓊脂糖平板擴(kuò)散法[7]檢測(cè)抗菌肽的活性。將1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3分別放在0、25、50、75和100 ℃中處理30 min，以檢測(cè)抗菌肽的熱穩(wěn)定性。用濃度為250、200、150、100和50 mmol·L-1的NaCl溶液稀釋抗菌肽，使抗菌肽濃度為1 mg·mL-1，作用30 min，以檢測(cè)抗菌肽的鹽穩(wěn)定性。用1 mol·L-1的HCl和NaOH調(diào)整LB培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，以檢測(cè)抗菌肽的酸堿穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1設(shè)計(jì)抗菌肽JH-3理化特性

將正電荷引入抗菌肽序列，可以影響抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合效率，可提高殺菌活性?？咕腏H-3是將牛血紅蛋白源抗菌肽P3的第一位纈氨酸(V)和第二位天冬氨酸(N)都替換為精氨酸(R)后設(shè)計(jì)并合成的類(lèi)似物多肽，其分子式為RRFKLLSHSLLVTLASHL。從表1中可以看出，抗菌肽JH-3的靜電荷比原抗菌肽P3增加了2個(gè)凈電荷數(shù)。

2.2抑菌活性檢測(cè)

2.2.1抗菌肽JH-3的抑菌活性從表2可以看出，JH-3的抑菌活性比原抗菌肽P3的高。JH-3對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌和真菌的抑菌活性略有不同，對(duì)測(cè)定的革蘭陰性菌的MIC為3.125～50 μg·mL-1，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的MIC為6.25～25 μg·mL-1，對(duì)真菌的MIC為12.5 μg·mL-1，表明抗菌肽JH-3具有廣譜的抗菌活性。

表1設(shè)計(jì)肽JH-3的理化性質(zhì)

Table 1Properties of design peptide JH-3

表2抗菌肽JH-3 MIC的測(cè)定

Table 2 Determination MIC of antimicrobial peptide JH-3

ND.No detection

2.2.2電鏡觀(guān)察從圖1的掃描電鏡可以看出，經(jīng)過(guò)MIC濃度的抗菌肽處理30 min后，大腸桿菌菌體已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，菌體細(xì)胞表面凹凸不平，某些細(xì)菌斷裂，表面出現(xiàn)孔洞性開(kāi)口，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)含物泄漏(圖1D)；金黃色葡萄球菌形態(tài)發(fā)生變化，菌體皺縮，細(xì)胞的完整性受到破壞(圖1E)；白色念珠菌細(xì)胞膜表面出現(xiàn)凹陷、突出、裂痕(圖1F)。這表明，抗菌肽JH-3嚴(yán)重破壞了革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌和真菌細(xì)胞的完整性。

2.3溶血活性測(cè)定

如圖2所示，在312.5 μg·mL-1時(shí)，抗菌肽JH-3的溶血率為12.84%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于50%，而這一濃度超過(guò)抗菌肽MIC的6～100倍。這表明，抗菌肽JH-3對(duì)紅細(xì)胞的滲透脆性影響很小，有較高的安全性。

2.4穩(wěn)定性分析

一些外界因素會(huì)影響抗菌肽的抑菌活性，如溫度、離子強(qiáng)度、酸堿性等。由圖3A可知，1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3經(jīng)不同溫度處理30 min，抑菌活性隨著溫度增加而有所減弱，但是在100°C處理30 min后，JH-3抗菌肽仍具有抑菌活性。這表明，抗菌肽JH-3具有一定的熱穩(wěn)定性。由圖3B 可知，JH-3抗菌肽在小于或大于0.9%(154 mmol·L-1)NaCl鹽溶液中，其抑菌活性?xún)H輕微減弱，這表明，離子濃度對(duì)抗菌肽JH-3的抑菌活性沒(méi)有顯著影響。由圖3C可知，在pH為7時(shí)，抗菌肽JH-3的抑菌活性最高，而在pH 4～7和pH 7～10時(shí)，抗菌肽JH-3仍有抑菌活性。這表明抗菌肽JH-3可以在較寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮抑菌活性。

3討論

近年來(lái)，由于傳統(tǒng)抗生素不合理使用所造成的細(xì)菌耐藥、藥物殘留問(wèn)題日漸突出，且對(duì)人類(lèi)的健康造成了極大的威脅[17-18]。在尋找傳統(tǒng)抗生素替代品的過(guò)程中，抗菌肽以其分布廣、不易產(chǎn)生耐藥性、不易產(chǎn)生藥物殘留的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[6，19]，但是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性和溶血性等缺陷[6，16，19]，這在一定程度上阻礙了抗菌肽的臨床應(yīng)用。因此，尋找高效抗菌活性的抗菌肽成為必然趨勢(shì)。

目前，一般認(rèn)為抗菌肽的電荷量和疏水性會(huì)影響其抗菌活性[20]。因此，在抗菌肽的研究過(guò)程中，通常采用改變其多肽鏈電荷量或疏水性的方式對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行分子改造，以獲得具有良好抑菌活性、

且細(xì)胞毒性較小的抗菌肽類(lèi)似物。A.P.Subasinghage等[21]以賴(lài)氨酸(K)替代抗菌肽XT-7序列中的甘氨酸(G)降低其溶血性，而且還增加了對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺菌能力。H.S.Ahn等[22]將昆蟲(chóng)防御素片段Tenecinl中的三個(gè)氨基酸突變?yōu)閺?qiáng)堿性的色氨酸(W)和賴(lài)氨酸(K)，使無(wú)活性的片段具備了抗真菌和抗細(xì)菌活性，且溶血性并無(wú)增加。JH-3是通過(guò)對(duì)牛紅細(xì)胞血紅蛋白源抗菌肽P3的氨基酸序列進(jìn)行分子改造設(shè)計(jì)的類(lèi)似物，以精氨酸(R)分別替代P3序列N段的纈氨酸(V)、天冬氨酸(N)，有效提高了正電荷量。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，改造后的JH-3對(duì)細(xì)菌和真菌的殺菌作用有明顯的提高，且溶血率較低，對(duì)鹽、熱和酸堿的穩(wěn)定性較好。下一步，將通過(guò)色氨酸或賴(lài)氨酸等替換P3或JH-3中的部分氨基酸，進(jìn)行抗菌活性及溶血率和穩(wěn)定性等方面的檢測(cè)，以期找到更好的有價(jià)值的抗菌肽。

目前，關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一的理論體系。但是，大多數(shù)人認(rèn)為作用于細(xì)菌細(xì)胞膜是抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵[19]。本試驗(yàn)通過(guò)電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，抗菌肽JH-3處理后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌出現(xiàn)不同程度的受損，如細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮、孔洞樣結(jié)構(gòu)、凹陷、突出、裂痕等，表明抗菌肽JH-3作用于細(xì)菌后，破壞了細(xì)胞膜的完整性。

抗菌肽抗菌活性的穩(wěn)定性會(huì)受到許多因素的影響，如溫度、酸堿性、離子濃度等[23]。溫度過(guò)高會(huì)逐漸降低抗菌肽的抗菌活性。吳瓊英等[24]研究乳源抗菌肽抑菌活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性隨著溫度的升高逐漸減弱。pH可以影響抗菌肽的抗菌能力。S.G.Dashper等[25]發(fā)現(xiàn)抗菌肽kappacin的抗菌活性在酸性環(huán)境下才具有活性，認(rèn)為pH影響抗菌肽與細(xì)胞膜的結(jié)合。離子導(dǎo)致的電荷變化會(huì)使抗菌活性降低。大多數(shù)β-防御素在150 mmol·L-1氯化鈉濃度下會(huì)喪失生物活性[26]。本試驗(yàn)對(duì)抗菌肽JH-3耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，抗菌肽JH-3具有較好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性。這為抗菌肽JH-3今后的實(shí)際應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

抗菌肽JH-3具有較好的抗革蘭陽(yáng)性菌、抗革蘭陰性菌和抗真菌的活性，使細(xì)菌或真菌的細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)、凹陷、皺縮、裂痕，有較低的溶血率，有較好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性。抗菌肽JH-3具有代替抗生素在臨床上應(yīng)用的潛力，為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]LUINI M，CREMONESI P，MAGRO G，et al.Methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) is associated with low within-herd prevalence of intra-mammary infections in dairy cows：Genotyping of isolates[J].VetMicrobiol，2015，178(3-4)：270-274.doi：10.1016/j.vetmic.2015.05.010.

[2]DORON S，HIBBERD P L，GOLDIN B，et al.Effect of lactobacillus rhamnosus GG administration on vancomycin-resistant Enterococcus colonization in adults with comorbidities[J].AntimicrobAgentsChemother，2015，59(8)：4593-4599.pii：AAC.00300-15.

[3]IGLESIAS A，NEBOT C，VZQUEZ B I，et al.Detection of veterinary drug residues in surface waters collected nearby farming areas in Galicia，North of Spain[J].EnvironSciPollutResInt，2014，21(3)：2367-2377.

[4]PUGH D M.The EU precautionary bans of animal feed additive antibiotics[J].ToxicolLett，2002，128(1-3)：35-44.

[5]ALLERBERGER F，F(xiàn)IDA P，GROSSGUT R，et al.Antibiotics in horticulture and antibiotic feed additives in animal husbandry，Austria 2002[J].WienKlinWochenschr，2003，115(17-18)：615-617.

[6]GIULIANI A，RINALDI A C.Antimicrobial peptides：methods and protocols[M].Humana Press Inc，2010.

[7]BROWN K L，POON G F，BIRKENHEAD D，et al.Host defense peptide LL-37 selectively reduces proinflammatory macrophage responses[J].JImmunol，2011，186(9)：5497-5505.

[8]CHARNLEY M，MOIR A J，DOUGLAS C W，et al.Anti-microbial action of melanocortin peptides and identification of a novel X-Pro-D/L-Val sequence in Gram-positive and Gram-negative bacteria[J].Peptides，2008，29(6)：1004-1009.

[9]ZHANG M，VOLPERT O，SHI Y H，et al.Maspin is an angiogenesis inhibitor[J].NatMed，2000，6(2)：196-199.

[10]ZASLOFF M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J].Nature，2002，415(6870)：389-395.

[11]陳琛，王新華，薄新文.綿羊生殖道抗菌肽[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36(11)：1483-1489.

CHEN C，WANG X H，BO X W.Antibacterial peptides of the ovine reproductive tract[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics，2009，36(11)：1483-1489.(in Chinese)

[12]APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php.

[13]HU J H，XU M L，HANG B L，et al.Isolation and characterization of an antimicrobial peptide from bovine hemoglobin a subunit[J].WorldJMicrobialBiotechnol，2011，27(4)：767-771.

[14]ZHANG Q H，XU Y Z，WANG Q，et al.Potential of novel antimicrobial peptide P3 from bovine erythrocytes and its analogs to disrupt bacterial membranesinvitroand display activity against drug-resistant bacteria in a mouse model[J].AntimicrobAgentsChemother，2015，59(5)：2835-2841.

[15]RENNIE R P，TURNBULL L，BROSNIKOFF C，et al.First comprehensive evaluation of the M.I.C testing of aerobic Gram-positive and Gram-negative bacterial species[J].JClinMicrobiol，2012，50(4)：1147-1152.[16]馬清泉，單安山，董娜，等.富含亮氨酸和精氨酸的抗菌肽設(shè)計(jì)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(6)：804-807.MA Q Q，SHAN A S，DONG N，et al.De novo design of a Leu-Arg-rich antimicrobial peptide[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2011，42(6)：804-807.(in Chinese)

[17]PENESYAN A，GILLINGS M，PAULSEN I T.Antibiotic discovery：Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities[J].Molecules，2015，20(4)：5286-5298.

[18]WANG H，WANG B，ZHAO Q，et al.Antibiotic body burden of Chinese school children：a multisite biomonitoring-based study[J].EnvironSciTechnol，2015，49 (8)：5070-5079.

[19]胡建和，杭柏林，徐彥召，等.動(dòng)物源抗菌肽[M].北京：科學(xué)出版社，2015.

HU J H，HANG B L，XU Y Z，et al.Animal origin of antimicrobial peptides[M].Beijing：Science Press，2015.(in Chinese)

[20]WIMLEY W C.Describing the mechanism of antimicrobial peptide action with the interfacial activity model[J].ACSChemBiol，2010，5(10)：905-917.

[21]SUBASINGHAGE A P，CONLON J M，HEWAGE C M.Development of potent anti-infective agents from Silurana tropicalis：conformational analysis of the amphipathic，alpha-helical antimicrobial peptide XT-7 and its non-haemolytic analogue[G4K]XT-7[J].BiochimBiophysActa，2010，1804(4)：1020-1028.

[22]AHN H S，CHO W，KANG S H，et al.Design and synthesis of novel antimicrobial peptides on the basis of alpha helical domain of Tenecin1，an insect defensin protein，and structure-activity relationship study[J].Peptides，2006，27(4)：640-648.

[23]GHAHREMANPOUR M M，SARDARI S.The effect of structural parameters and positive charge distance on the interaction free energy of antimicrobial peptides with membrane surface[J].JBiomolStructDyn，2015，33(3)：502-512.

[24]吳瓊英，茅妍.乳源抗菌肽的抑菌活性及其影響因素[J].江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，24(2)：184-187.

WU Q Y，MAO Y.Antibacterial activity and influential factors of milk-derived antimicrobial peptides[J].JournalofJiangsuUniversityofScienceandTechnology(NaturalScienceEdition)，2010，24(2)：184-187.(in Chinese)

[25]DASHPER S G，O′BRIEN-SIMPSON N M，CROSS K J，et al.Divalent metal cations increase the activity of the antimicrobial Peptide kappacin[J].AntimicrobAgentsChemother，2005，49(6)：2322-2328.

[26]WANG G，NAUSEEF W M.Salt，chloride，bleach，and innate host defense[J].JLeukocBiol，2015，98(2)：163-172.

(編輯白永平)

Analysis of Antimicrobial Activity and Stability of Antibacterial Peptide JH-3

WEI Xiao-xiao，HANG Bo-lin*，MA Cui，XIA Yi-he，ZHANG Bing-qing，WANG Qing，XU Yan-zhao，HU Jian-he*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China)

Key words:antibacterial peptide JH-3；antibacterial activity；haemolytic activity；stability

Abstract:The aim of the present study was to modify antimicrobial peptide P3 from bovine hemoglobin on amino acid，and to know the antibacterial activity and stability of the antibacterial peptide JH-3 modified based on P3.The minimum inhibitory concentrations (MIC) of JH-3 against several bacteria were detected with the method of serial dilution.The morphology changes of bacterial and fungus were observed by scanning electron microscope (SEM).The hemolytic activity，thermal stability，acid base stability and salt stability of the antibacterial peptide JH-3 were determined.The results showed that the MIC of JH-3 against gram positive bacteria (Staphylococcusaureus，Streptococcussuis2 type) was between 6.25-25 μg·mL-1.The MIC against Gram negative bacteria (Escherichiacoli，Salmonellacholeraesuis，Haemophilusparasuis，Actinobacilluspleuropneumoniae) was between 3.125-50 μg·mL-1.The MIC against fugus (Moniliaalbicans) was 12.5 μg·mL-1.Shrinkage and holes appeared on the surface of treatedE.colicells.Shrinkage and incomplement presented on the cell surface ofS.Aureus.AndM.albicanshowed sunken，protruding and crack.Hemolytic rate of JH-3 was only 12.84% at 312.5 μg·mL-1(6-100 times MIC).At the condition of 75-100 ℃，80-100 mmol·L-1NaCl，pH 4 and pH 10，the antimicrobial activity of JH-3 was not changed significantly.These findings provided theoretical basis for the clinical application of antimicrobial peptide JH-3，and antibacterial peptide JH-3 has the potential as the new antibacterial drugs instead of antibiotics.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.020

收稿日期：2015-07-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372469)；河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(142300410142)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(15IRTSTHN)；河南科技學(xué)院2015年大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2015CX035)；教育部2015年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510467005)

作者簡(jiǎn)介：魏曉曉(1990-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原與新獸藥的研究，E-mail：weixiaoxiao926@163.com *通信作者：胡建和，E-mail:hujianhe@hist.edu.cn；杭柏林，E-mail:yzhbl001@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0361-06