顧有方，李文超，汪　凱，靳二輝，胡倩倩，李升和，陳會(huì)良

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，鳳陽 233100)

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表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲HMGB1基因質(zhì)粒DNA的免疫效果分析

顧有方，李文超，汪凱，靳二輝，胡倩倩，李升和，陳會(huì)良

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，鳳陽 233100)

摘要：旨在評(píng)價(jià)表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)HMGB1基因質(zhì)粒DNA免疫對(duì)同源株攻蟲的免疫保護(hù)效果。將EtHMGB1基因插入pcDNA3.1(-)/myc-His A真核表達(dá)載體中，并在Hela細(xì)胞中進(jìn)行體外瞬時(shí)表達(dá)。設(shè)計(jì)了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫組、pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫組、重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組、pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組、FCA佐劑免疫組、未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組7個(gè)試驗(yàn)組。分別于14和21日齡對(duì)雞進(jìn)行兩次免疫，28日齡時(shí)除未免疫未攻蟲組外各組用1×104個(gè)E.tenella孢子化卵囊攻蟲，以平均增重、卵囊產(chǎn)量和病變記分作為免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后該質(zhì)粒可在Hela細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。該重組質(zhì)粒單獨(dú)免疫、重組蛋白質(zhì)單獨(dú)免疫或重組質(zhì)粒與重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫均對(duì)雞腸道病變改善效果不明顯，但可顯著提高增重，降低卵囊產(chǎn)量，尤以重組質(zhì)粒與重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫效果最佳，顯示Prime-boost免疫策略可提高該重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。上述結(jié)果顯示HMGB1可作為未來球蟲疫苗研制的良好候選抗原之一。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；高遷移率組蛋白；真核表達(dá)；免疫保護(hù)

雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的一種原蟲病，可造成雞死亡、代謝障礙、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，產(chǎn)蛋率下降等。目前防治球蟲病主要依靠藥物，但是由于耐藥蟲株(甚至多重耐藥蟲株)的出現(xiàn)，公眾對(duì)食品中藥物殘留的日益關(guān)注，研制新藥成本費(fèi)用高以及政府對(duì)抗球蟲藥使用的限制或禁止[1-2]，很多學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向用疫苗防治球蟲病。傳統(tǒng)的球蟲疫苗盡管已應(yīng)用多年，但存在規(guī)?；a(chǎn)受限制，易散毒，潛在致病性威脅等缺點(diǎn)[3]，限制了其在生產(chǎn)中的使用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研制亞單位重組疫苗或核酸疫苗已成為目前球蟲疫苗發(fā)展的方向，但這依賴于球蟲生活周期各階段特異性保護(hù)抗原的鑒定[4]。

高遷移率組蛋白(high mobility group protein，HMG)是一組含量豐富，進(jìn)化高度保守的核內(nèi)非組蛋白。HMGB1作為HMG的重要成員之一，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸之間關(guān)系密切，胞外的HMGB1是一種重要的炎癥前調(diào)節(jié)因子，可以和LPS一樣刺激炎癥反應(yīng)，引起宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染性免疫、自身性免疫及腫瘤免疫形成中起重要作用，是這些疾病潛在的治療靶點(diǎn)[5-6]。最近的研究顯示HMGB1是犬新孢子蟲引起機(jī)體Thl型免疫應(yīng)答的重要成員之一，其參與了激活TLR9而介導(dǎo)機(jī)體Thl型免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[7]。課題組從E.tenella轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒別出了一個(gè)假定HMGB1基因，在克隆并原核表達(dá)該基因的基礎(chǔ)上，作者又構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而研究表達(dá)EtHMGB1基因質(zhì)粒DNA的免疫保護(hù)作用，為進(jìn)一步探索球蟲HMGB1基因的功能及在雞球蟲病免疫預(yù)防中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1蟲株、菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株

E.tenella鳳陽株、pcDNA3.1(-)/myc-His A真核表達(dá)載體和Hela細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliTop10 購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD-EtHMGB1載體和表達(dá)pET28a-EtHMGB1的Rosetta(DE3)菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1日齡固始雞苗300只，購自鳳陽當(dāng)?shù)胤趸瘓?chǎng)，飼養(yǎng)于消毒后無球蟲污染的鐵絲籠中。飼料系自行配制，不含任何抗球蟲藥，飼喂前80 ℃烘烤2 h，飲用水為煮沸處理不含球蟲卵囊的自來水。

1.3主要試劑

BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA 連接酶、DL2000 Marker等為TaKaRa公司產(chǎn)品；凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒為Biolux公司產(chǎn)品；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑為Roche公司產(chǎn)品；抗E.tenella陽性血清為本實(shí)驗(yàn)室自制，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)在1∶12 800以上；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(FITC-IgG)為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；Blue Plus Protein Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4E.tenellaHMGB1基因的擴(kuò)增

根據(jù)本室構(gòu)建的含E.tenellaHMGB1全長(zhǎng)基因的pMD-EtHMGB1質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物，P1：5′-GGATCCATGACGAGCAACAAGAGCAG-3′ (下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，P2：5′-CTCGAGCTATTTGTGCTGCTTGTAGG-3′(下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。然后以pMD-EtHMGB1質(zhì)粒為模板，以P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增EtHMGB1基因。

1.5真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

EtHMGB1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1(-)/myc-His A質(zhì)粒分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收后連接、轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1。

1.6pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1的體外瞬時(shí)表達(dá)與鑒定

按轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書的方法將pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1轉(zhuǎn)染于生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右的Hela單層細(xì)胞。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)42 h，固定細(xì)胞，以E.tenella陽性血清為一抗，以羊抗鼠FITC-IgG為二抗，做間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)pcDNA3.1(-)/myc-His A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞及正常Hela細(xì)胞作對(duì)照組。

1.7表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析

胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h的Hela細(xì)胞，同時(shí)取未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞作對(duì)照，將細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，以E.tenella陽性血清為一抗，以羊抗鼠HRP-IgG為二抗，加入ECL發(fā)光液，X光曝光，顯影，定影后分析鑒定。

1.8動(dòng)物分組及免疫

雛雞飼養(yǎng)至14日齡，剔除弱雛后，逐只編號(hào)，稱重，隨機(jī)分為7組，即pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫組，pcDNA3.1(-)/myc-HisA免疫組，重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組，F(xiàn)CA佐劑免疫組，未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組，每組20只雞，各組體況和體重相近。各組均采用肌肉注射免疫，免疫前20 min于免疫部位預(yù)先注射0.2 mL的25%蔗糖溶液并按摩，然后同一部位注射相應(yīng)劑量的重組質(zhì)粒(或PBS)，21日齡時(shí)加強(qiáng)免疫1次。其中，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組14日齡時(shí)用pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1質(zhì)粒免疫，21日齡時(shí)用重組蛋白質(zhì)免疫，未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組均用PBS進(jìn)行免疫。28日齡時(shí)，除未免疫未攻蟲組外，其余各組每只雞均經(jīng)口感染1×104個(gè)新鮮E.tenella孢子化卵囊，具體免疫和攻蟲情況見圖1。上述試驗(yàn)重復(fù)1次。

1.9免疫保護(hù)評(píng)價(jià)指標(biāo)

攻蟲前，各組雞逐只稱重，攻蟲后每天觀察雞的精神、食欲、糞便與發(fā)病情況，從攻蟲后第5天(33日齡)至第10天末(38日齡)，每天收集各組全部糞便，麥克馬斯特法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。攻蟲后第7天末，每組剖殺10只雞，參照J(rèn).Johnson等的方法[8]進(jìn)行盲腸病變記分。攻蟲后第10天末(38日齡)各組雞逐只稱重。用平均增重、卵囊產(chǎn)量和病變記分作為免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。

1.10血清抗體水平檢測(cè)

分別于一免、二免 (14和21日齡)及攻蟲前(28日齡)隨機(jī)從每組中選取5只雞采血，分離血清，參照W.C.Li等[2]的方法用ELISA檢測(cè)血清抗體水平。

1.11數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA analysis)中的Student-New man-Keuls Test，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1EtHMGB1基因PCR

以重組質(zhì)粒pMD-EtHMGB1為模板，擴(kuò)增EtHMGB1基因，電泳顯示在430 bp附近有一清晰條帶，與預(yù)計(jì)大小相符(圖2)。

2.2重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定能擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)生5 500和430 bp兩條帶，與預(yù)期相符，質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒。

2.3EtHMGB1在Hela細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定

間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重組質(zhì)粒的細(xì)胞中可見明顯的綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-His A質(zhì)?；蛭崔D(zhuǎn)染的細(xì)胞中未見熒光(圖3)，結(jié)果表明重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1基因在Hela細(xì)胞中得到了表達(dá)。Western blot顯示轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重組質(zhì)粒的細(xì)胞可見到一條約16 ku的特異性表達(dá)條帶。而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞中未見到條帶(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)了EtHMGB1蛋白在Hela細(xì)胞中得到了有效表達(dá)，而且其能被鼠抗雞E.tenella球蟲免疫血清識(shí)別，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。

2.4免疫保護(hù)效果

從表1可知，除pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫組和FCA佐劑免疫組外，其余各疫苗免疫組體重獲得與未免疫攻蟲組相比均顯著增加(P<0.05)，尤以pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組的體重獲得增加最為明顯，接近未免疫未攻蟲組體重獲得，但 pcDNA3.1(-)/myc-EtH-MGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組的體重獲得與pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫組和重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組相比，差異均不顯著(P>0.05)。各攻蟲組在攻蟲后均有不同數(shù)量的卵囊排出，其中以未免疫攻蟲組、FCA佐劑免疫組和pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫組排出量較多，三者之間差異均不顯著(P>0.05)。其他各免疫組卵囊產(chǎn)量與未免疫攻蟲組相比均顯著下降(P<0.05)，其中以pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組卵囊產(chǎn)量下降最為明顯，而且該組卵囊產(chǎn)量與重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組相比也差異顯著(P<0.05)，但與pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫組相比無顯著差異(P>0.05)。各免疫組的平均病變記分與未免疫攻蟲組相比，雖有不同程度的降低，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.5血清抗體水平

以重組EtHMGB1蛋白作為檢測(cè)用抗原，包被ELISA 板，間接ELISA 法對(duì)一免、二免 (14和21日齡)及攻蟲前(28日齡) 收集的雞血清中的IgG 進(jìn)行測(cè)定，如圖5所示，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組IgG水平均顯著高于pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫組和重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組(P<0.05)。

表1表達(dá)EtHMGB1基因質(zhì)粒DNA免疫經(jīng)同源株攻蟲后對(duì)雞增重、病變記分和卵囊產(chǎn)量的影響

Table 1Effect of the plasmid encodingEtHMGB1 vaccination on body weight gain，fecal oocyst shedding，and lesion scores following oral challenge infection withE.tenella

同列中不同字母肩注表示差異顯著(P<0.05)；相同字母肩注表示平均值差異不顯著(P>0.05)

In the same column，the different capital letters mean significant difference (P<0.05)；The same capital letter means no difference(P>0.05)

3討論

HMGB1以其多樣的生物學(xué)效應(yīng)及與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸之間的密切關(guān)系，受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。但現(xiàn)有研究主要集中在對(duì)哺乳動(dòng)物HMGB1蛋白方面，寄生蟲HMGB1的研究剛剛起步，相關(guān)報(bào)道很少，主要著重于已發(fā)現(xiàn)HMGB1基因的克隆以及假定蛋白的確認(rèn)等[9-11]，有關(guān)寄生蟲HMGB1基因及其蛋白的功能，作用機(jī)制、釋放、信號(hào)通路等卻鮮有報(bào)道。

本課題組用生物信息學(xué)的方法，已鑒別了一個(gè)假定的E.tenellaHMGB1基因，該基因編碼蛋白具有與屬于頂復(fù)門原蟲的新孢子蟲HMGB1類似的結(jié)構(gòu)域。研究證實(shí)球蟲感染常會(huì)刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ等炎癥因子，從而誘導(dǎo)機(jī)體Th1型免疫應(yīng)答[12]，而NcHMGB1是犬新孢子蟲引起機(jī)體Thl型免疫應(yīng)答的重要成員之一[7]，是否球蟲HMGB1與NcHMGB1一樣具有誘發(fā)宿主的Thl型免疫應(yīng)答的能力以及球蟲HMGB1在球蟲免疫中的作用大小，取決于球蟲HMGB1是否是一個(gè)良好的保護(hù)性抗原。

球蟲疫苗研究目前主要集中在核酸疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗方面，盡管也取得了一些進(jìn)展，但免疫效果還是不盡理想，因此改善免疫策略來提高球蟲疫苗的免疫效果是未來球蟲疫苗發(fā)展的方向之一[13]。研究顯示，聯(lián)合運(yùn)用性質(zhì)不同的核酸疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗進(jìn)行免疫接種可增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而有效地提高疫苗效果[14-15]。因此本研究在構(gòu)建pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1真核表達(dá)質(zhì)粒并在體外進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)后，利用初免-加強(qiáng)(Prime-boost) 免疫策略進(jìn)一步探討了表達(dá)EtHMGB1基因質(zhì)粒DNA的免疫保護(hù)作用。

本研究中，構(gòu)建的pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒在細(xì)胞中成功進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，Western blot顯示在Hela細(xì)胞中表達(dá)的EtHMGB1蛋白可被鼠抗雞E.tenella球蟲免疫血清識(shí)別，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。免疫保護(hù)試驗(yàn)的增重結(jié)果顯示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫組、重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組以及pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組的與未免疫攻蟲組相比，體重增加均明顯，尤其是pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組的體重增加最為明顯，接近未免疫未攻蟲組，表明重組質(zhì)粒或重組蛋白質(zhì)單獨(dú)免疫均可顯著降低攻蟲對(duì)動(dòng)物體重增加的影響，但重組質(zhì)粒和重組蛋白質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用在體重增加上效果更好，分析其原因可能與Prime-boost免疫策略可發(fā)揮兩種疫苗在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的不同優(yōu)勢(shì)，從而增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的效果，進(jìn)而通過改善攻蟲雞腸道生理狀況，增加腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收能力或降低球蟲的細(xì)胞毒性而發(fā)揮在增重方面的作用[2，16]。卵囊產(chǎn)量結(jié)果顯示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組卵囊產(chǎn)量下降最為明顯，卵囊產(chǎn)量?jī)H為未免疫攻蟲組卵囊產(chǎn)量的21.11%，而且該組卵囊產(chǎn)量與重組蛋白質(zhì)+FCA佐劑免疫組相比也下降顯著。病變記分結(jié)果顯示重組質(zhì)?；蛑亟M蛋白質(zhì)單獨(dú)免疫以及兩者聯(lián)合免疫對(duì)球蟲感染雞腸道損傷的改善作用均不明顯，這一結(jié)果與吳紹強(qiáng)等[17]的結(jié)果一致，結(jié)合卵囊產(chǎn)量結(jié)果考慮，暗示重組質(zhì)?；蛑亟M蛋白質(zhì)單獨(dú)免疫或兩者聯(lián)合免疫可能對(duì)球蟲子孢子/裂殖子入侵的抑制作用不明顯，但可抑制球蟲發(fā)育、繁殖，故導(dǎo)致球蟲感染雞腸道病變改善不明顯，而卵囊產(chǎn)量下降明顯，分析其原因可能與Prime-boost免疫策略增強(qiáng)了疫苗的抗生殖作用有關(guān)[18]。血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果也顯示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)了較高抗體水平，顯示Prime-boost免疫策略可提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答水平，這一結(jié)果與J.Min等[19]的研究結(jié)果一致，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

4結(jié)論

綜合平均增重、卵囊產(chǎn)量和病變記分三個(gè)指標(biāo)分析表明表達(dá)EtHMGB1基因的質(zhì)粒DNA具有較好的免疫保護(hù)效果，HMGB1可作為球蟲疫苗研制的良好候選抗原之一。

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(編輯白永平)

Protective Immunity Induced by a Plasmid EncodingEimeriatenellaHigh Mobility Groupbox1 Gene against Homologous Challenge

GU You-fang，LI Wen-chao，WANG Kai，JIN Er-hui，HU Qian-qian，LI Sheng-he，CHEN Hui-liang

(CollegeofAnimalScience，AnhuiScienceandTechnologyUniversity，F(xiàn)engyang233100，China)

Key words:Eimeriatenella；high mobility group box1；eukaryotic expression；protective immunity

Abstract:This experiment was conducted to assess the immuno-efficacy of the eukaryotic plasmid.The high mobility group box1 gene fromEimeriatenellawas inserted into expression vector pcDNA3.1(-)/myc-His A，and then constructed the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 and expressed transiently the objective protein in Hela cells.Seven experimental groups including pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 immunization group，pcDNA3.1(-)/myc-His A immunization group，recombinant antigen with adjuvant immunization group，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 with recombinant antigen prime-boost immunization group，F(xiàn)CA adjuvant immunization group，unimmunized and challenged group and unimmunized and unchallenged group were designed.Chickens were vaccinated at the age of 14 and 21 days.All birds except the unchallenged control group were challenged orally with 1×104E.tenellasporulated oocysts at 28 days.Gain of body weight，fecal oocyst output and lesion scores were assessed as measures of protective immunity.The results showed that the plasmid pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 was successfully constructed，and the transient expression product ofEtHMGB1 could be detected by IFA and Western blot.Challenge experiments demonstrated that pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 immunization，recombinant antigen with adjuvant immunization and pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 with recombinant antigen prime-boost immunization could all increase body weight gains and reduce oocyst excretion，but all three methods did not have an effect on cecal lesion.The prime-boost immunization strategy were superior to the other method based on the immune effects.These results suggest thatEtHMGB1 could be proposed as an anti-apicomplexan vaccine candidate.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.019

收稿日期：2015-07-23

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳重大項(xiàng)目(KJ2014ZD09)；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A189)；安徽省第七批“115”產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；安徽科技學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)項(xiàng)目(ZRC2014406)；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(AKZDXK2015A04)

作者簡(jiǎn)介：顧有方(1964-)，男，安徽全椒人，教授，博士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究，Tel：0550-6732036，E-mail：youfanggu@163.com

中圖分類號(hào)：S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0354-07