黃　莉，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，范　晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，王　盛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

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禽呼腸孤病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株感染Vero細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

黃莉，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，范晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，王盛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

摘要：為研究在禽呼腸孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同時間點(diǎn)宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)組變化，運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對ARV 強(qiáng)毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero細(xì)胞和對照細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測。鑒定結(jié)果表明，共鑒定出44個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包括α-烯醇化酶(α-enolase)、過氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、轉(zhuǎn)錄延伸因子等。 GO軟件分析顯示這些差異蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞信號、細(xì)胞骨架組成、能量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)功能。熒光定量RT-PCR驗(yàn)證表明，hnRNP和Prx-4在S1133感染細(xì)胞中表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，而Tubulin 和α-enolase 僅分別在48和24 h時表達(dá)上調(diào)，與雙向凝膠電泳的結(jié)果一致。以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示了ARV不同毒力毒株感染后細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異變化，有助于進(jìn)一步闡明ARV和宿主之間的相互作用。

關(guān)鍵詞：禽呼腸孤病毒；強(qiáng)毒株；弱毒疫苗株；Vero細(xì)胞；差異表達(dá)蛋白質(zhì)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV) 主要引起病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、矮小綜合征及吸收不良綜合征等，尤為嚴(yán)重的是誘發(fā)免疫抑制，造成機(jī)體對疫苗免疫應(yīng)答能力和各種病原體抵抗力降低[1-3]。近年來，中國大多數(shù)省、區(qū)、市都有ARV感染的報道，其雞群感染率可高達(dá)50%以上，已經(jīng)成為雞場中禽類免疫抑制病的主流，造成養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。ARV對宿主細(xì)胞的感染過程是病毒和宿主之間相互作用的結(jié)果和體現(xiàn)，會引起宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)模式發(fā)生改變。不同毒力的病毒感染宿主細(xì)胞后可導(dǎo)致宿主細(xì)胞啟動不同的防御機(jī)制和蛋白質(zhì)分子表達(dá)模式[6-7]。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)分析比較ARV強(qiáng)弱毒株感染前后宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，將為研究提供一個全新的視角來認(rèn)識ARV與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系，有助于在細(xì)胞水平上揭示病毒毒力不同對宿主細(xì)胞調(diào)控的差異，以及宿主細(xì)胞對此采取的相應(yīng)應(yīng)對策略，也有利于進(jìn)一步闡明ARV感染機(jī)制。

隨著近年來雙向凝膠電泳方法、質(zhì)譜鑒定等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和日益完善，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)成為研究病毒與宿主之間相互作用關(guān)系的有效高通量工具，并且在家禽病毒的研究中得到廣泛應(yīng)用，促進(jìn)了家禽病毒研究的高速發(fā)展[8]。吳雙等采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析新城疫病毒不同毒力毒株感染雞胚成纖維細(xì)胞后宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，驗(yàn)證了新城疫病毒可以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病毒的感染[9]。盧占軍利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究馬立克病毒超強(qiáng)毒株感染雞法氏囊的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，篩選出與馬立克病毒感染相關(guān)的一些重要宿主蛋白質(zhì)，為深入研究馬立克病致病性和致瘤性奠定基礎(chǔ)[10]。ARV S1133是禽呼腸孤病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株，可以感染致病雞群；而ARV aS1133是ARV S1133經(jīng)雞胚弱化形成的弱毒疫苗株，作為疫苗免疫，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，保護(hù)雞群抵抗禽呼腸孤病毒感染，兩者的功能作用不同。因此，在本研究中，選擇禽呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero細(xì)胞作為研究對象，對比和比較體外宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，并對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行初步的功能探討，在體外水平上探索和闡明ARV不同毒力毒株和宿主細(xì)胞的相互作用，也為下一步開展體內(nèi)研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑

尿素、硫脲、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸)、ASB-14，三正丁基膦(TBP)、甘油、IPG緩沖液(pH4～7)、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)、雙向電泳蛋白質(zhì)定量試劑盒、礦物油和IPG干膠條(pH3-10、pH4-7)均購自GE Healthcare公司，二硫蘇糖醇(DTT)、低溶點(diǎn)瓊脂糖、蛋白酶抑制劑雞尾酒混合液、DNase和RNaseI均購自Sigma公司。磷酸、乙醇、硫酸銨、乙酸、甲醇和鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器

等電聚焦儀、Ettan IPGphor 3垂直電泳槽、Image Scanner Ⅲ LabScan 透射掃描儀、LabScan軟件、ImageMaster 2D Platinum 6.0圖像分析軟件購自GE Healthcare公司；超聲波破碎儀Vibra cellTM、紫外分光光度儀(ND-1000)購自美國Nano Drop公司；旋渦混合器WH-861、水平搖床(WD-9405B )購自北京六一儀器廠。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和病毒接種

Vero 細(xì)胞生長在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)成單層細(xì)胞后，接種104TCID50的禽呼腸孤病毒液，感染后第12、24和48 小時(hpi)收集細(xì)胞，用于蛋白質(zhì)樣品的制備和后續(xù)分析。

1.4細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備

將感染后的細(xì)胞和空白對照細(xì)胞分別收集，加入細(xì)胞裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，2% CHAPS，20 mmol·L-1DTT，40 mmol·L-1Tris-CL，0.8% IPG緩沖液pH 4～7，1 mmol·L-1PMSF)進(jìn)行裂解，離心取上清，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。并吸取20 μL裂解上清，測量蛋白質(zhì)濃度，余下的蛋白質(zhì)樣品存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白質(zhì)樣品的濃度測定和SDS-PAGE電泳

為了確保各個蛋白質(zhì)樣品上樣量的一致性，在進(jìn)行雙向凝膠電泳前，按照Bio-Rad公司的Quick Start Bradford蛋白質(zhì)檢測試劑盒操作說明，對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量分析。每個標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品均做3個重復(fù)。為了進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)樣品的提取完整性和上樣量，根據(jù)待測樣品的蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整各樣品的上樣體積，吸取同等量蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.6水化和等電聚焦

將水化上樣液和1 mg蛋白質(zhì)樣品溶液混合，終體積為500 μL，緩慢地加入聚焦槽中，再放入24 cm pH 4～7的干膠條，使其充分地浸泡。在每條膠條上覆蓋1 mL礦物油，防止蛋白質(zhì)樣品揮發(fā)。將加好樣品的聚焦槽放入等電聚焦儀中，按照表1設(shè)置程序，進(jìn)行主動水化和等電聚焦。整個過程的溫度設(shè)置為20 ℃，每條膠條限流為50 μA。

表1等電聚焦程序

Table 1IPGphor running conditions

1.7平衡和聚丙烯酰胺凝膠電泳

等電聚焦結(jié)束后，將膠條從聚焦槽中取出，進(jìn)行平衡(平衡緩沖液Ⅰ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2% DTT；平衡緩沖液Ⅱ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2.5% 碘乙酰胺)。再將膠條轉(zhuǎn)移到12% 聚丙烯酰胺凝膠上，進(jìn)行第二向垂直電泳。電泳程序?yàn)?0 V恒壓下，跑膠30 min；然后在200 V恒定電壓下，電泳約8 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.8圖像掃描和軟件分析

染色結(jié)束后，用掃描儀掃描采集圖像。按照GE公司的使用說明書，采用ImageMaster 2D Platimun Software 7.01軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9質(zhì)譜鑒定

將差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切下，置于1.5 mL EP管中，送廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的蛋白質(zhì)組學(xué)平臺進(jìn)行樣品的質(zhì)譜鑒定。

1.10差異蛋白質(zhì)的GO分析

利用DAVID軟件，對質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析，預(yù)測和注釋其分子功能、可能參與的生物過程以及pathway，并對其進(jìn)行顯著性分析，探討和分析差異蛋白質(zhì)在ARV感染過程中的功能和作用。

1.11差異蛋白質(zhì)的Real-time RT-PCR驗(yàn)證

選擇部分差異蛋白質(zhì)，根據(jù)其在GenBank上發(fā)表的基因序列，設(shè)計特異引物(表2)，建立熒光定量RT-PCR檢測方法。

2結(jié)果

2.1ARV S1133和aS1133感染Vero細(xì)胞

如圖1所示，將104TCID50ARV S1133和aS1133感染Vero細(xì)胞后，從24 hpi開始，出現(xiàn)細(xì)胞變圓，細(xì)胞間空隙變大，到48 hpi時，細(xì)胞變圓聚集，出現(xiàn)明顯病變，甚至部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落，72 hpi時，細(xì)胞開始死亡，脫落。所以選取12、24和48 hpi的細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 熒光定量PCR檢測差異表達(dá)蛋白質(zhì)的引物序列

Table 2Primers used for detection of differentially expressed protein by qRT-PCR

2.2細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備

ARV S1133和aS1133感染 Vero細(xì)胞后的第12、24和48 小時，收集各組細(xì)胞，抽提蛋白質(zhì)，用Bradford方法檢測蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度，并調(diào)整為4～5 mg·mL-1，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，評估蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量。若抽提的蛋白質(zhì)樣品條帶完整清晰，可用于雙向凝膠電泳。

2.3雙向凝膠電泳分析

將S1133和aS1133分別感染的細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品和對照細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品，以同樣的蛋白質(zhì)量上樣，進(jìn)行雙向凝膠電泳分析。為了減少試驗(yàn)誤差，每個樣品重復(fù)3次，采用相同的實(shí)驗(yàn)條件。凝膠染色掃描獲得圖像數(shù)據(jù)后，利用ImageMaster 2D Platium Software 7.01軟件分析蛋白質(zhì)點(diǎn)，選擇表達(dá)差異≥2.0的蛋白質(zhì)點(diǎn)為顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果顯示，3個感染時間點(diǎn)樣品中共篩選出顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)61個(圖2)。

2.4質(zhì)譜鑒定和分析

將表達(dá)差異顯著的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切下，膠內(nèi)胰酶消化，進(jìn)行MALDI-TOF MS/MS+MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和分析，使用MASCOT搜索引擎對NCBI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，結(jié)果成功鑒定了44 個蛋白質(zhì)點(diǎn)，屬于33種蛋白質(zhì)(表3～5)。在12 hpi時，上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)有5個，下調(diào)蛋白質(zhì)6個；24 hpi時，13個上調(diào)蛋白質(zhì)，3個下調(diào)蛋白質(zhì)；48 hpi時，13個上調(diào)蛋白質(zhì)，4個下調(diào)蛋白質(zhì)。

運(yùn)用DAVID軟件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能分析，差異蛋白質(zhì)可以分為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)(如heat shock protein 27，Peroxiredoxin-4，alpha-enolase)、生物代謝相關(guān)蛋白質(zhì)(如thioredoxin domain-containing protein 5，hnRNP H1，hnRNP K)、生物合成轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)(如protein disulfide isomerase，peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 3 isoform)、細(xì)胞骨架蛋白(如tubulin，tropomyosin alpha-3 chain isoform 3)以及未知蛋白質(zhì)等(圖3)。差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能分析結(jié)果說明與ARV aS1133感染相比，細(xì)胞受到ARV S1133感染后，細(xì)胞骨架蛋白、與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)折疊相關(guān)蛋白質(zhì)、信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)和生物代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生改變，引起細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的改變甚至破壞，細(xì)胞內(nèi)外的信號傳導(dǎo)調(diào)控、細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的平衡維持被打破，最后導(dǎo)致細(xì)胞的生物合成和代謝也遭到破壞，這可能是由于ARV S1133和aS1133之間的毒力不同，進(jìn)而對宿主細(xì)胞造成的影響也不同。

2.5熒光定量RT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證雙向凝膠電泳數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選擇4個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，用熒光定量RT-PCR方法對其在12、24和48 hpi 時的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4所示，與aS1133感染的細(xì)胞相比，hnRNP和Prx-4在S1133感染細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上升，而Tubulin和a-enolase僅分別在48和24 h時轉(zhuǎn)錄上調(diào)，與雙向凝膠電泳的結(jié)果一致。

表3ARV S1133和aS1133感染Vero細(xì)胞后12 h的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Table 3Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 12 hpi

表4ARV S1133和aS1133感染Vero細(xì)胞后24 h的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Table 4Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 24 hpi

表5ARV S1133和aS1133感染Vero細(xì)胞后48 h的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Table 5Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 48 hpi

3討論

在本研究中，通過雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定方法，尋找ARV強(qiáng)毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero細(xì)胞后不同時間點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。結(jié)果顯示，ARV強(qiáng)毒株感染細(xì)胞后，相比較于弱毒疫苗株，能夠引起一些與細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成與代謝等相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，包括微管蛋白、α-烯醇化酶、過氧化物酶等。

研究表明，許多病毒在感染宿主時，能夠改變和利用細(xì)胞骨架蛋白，調(diào)控宿主生理活動過程中相關(guān)酶類蛋白質(zhì)的活性和功能，以實(shí)現(xiàn)病毒的侵入、復(fù)制以及持續(xù)感染等[11]。X.Zheng等對傳染性法氏囊病病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)，如Tubulin、Viementin等在表達(dá)上發(fā)生顯著性變化[12]。王曉虎發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒感染N2a細(xì)胞時，誘導(dǎo)了α-烯醇化酶的上調(diào)，加速了糖酵解途徑，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生存期，維持狂犬病病毒的持續(xù)性感染[13]。此外，抗氧化物酶類蛋白質(zhì)，如Peroxiredoxin-4(Prx-4)等，經(jīng)研究證實(shí)是一個NF-κB信號通路和c-Jun N端激酶的硫氧還蛋白過氧化物酶相關(guān)激活劑，對清除細(xì)胞中的活性氧、細(xì)胞增殖、凋亡具有調(diào)控作用，還廣泛參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)[14]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)相比較于ARV S1133感染，aS1133 ARV感染細(xì)胞中這些蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著性改變，根據(jù)參考文獻(xiàn)報道，推測Tubulin等細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)可能與ARV感染宿主細(xì)胞過程中的細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)；hnRNP蛋白的表達(dá)上調(diào)可能與ARV感染時細(xì)胞能量代謝、核酸代謝的改變有關(guān)；α-烯醇化酶和Prx-4等蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)可能與ARV感染時細(xì)胞的應(yīng)答有關(guān)。這些結(jié)果也表明ARV不同毒株的毒力差異導(dǎo)致了感染細(xì)胞的應(yīng)答結(jié)果不同，進(jìn)而決定了病毒的感染進(jìn)程和宿主的應(yīng)答反應(yīng)結(jié)果。

由于雙向凝膠電泳技術(shù)的局限性，一些相對分子質(zhì)量過大、過小的蛋白質(zhì)或極性蛋白質(zhì)不能檢測出，并且也不能精確地定量出差異蛋白質(zhì)在不同感染時間點(diǎn)的表達(dá)量變化，在以后試驗(yàn)中考慮采用其他方法做進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

采用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，進(jìn)行了禽呼腸孤病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗感染宿主細(xì)胞后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得了44個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步理解禽呼腸孤病毒感染致病機(jī)制和宿主免疫應(yīng)答機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

Proteomic Analysis of Vero Cells Infected by Avian Reovirus Virulent Strain and Attenuated Vaccine Strain

HUANG Li，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，F(xiàn)AN Qing，LUO Si-si，HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting，ZHANG Yan-fang，WANG Sheng

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology，GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

Key words:avian reovirus；virulent strain；attenuated vaccine strain；Vero cells；differentially expressed proteins

Abstract:To discover protein expression changes in infected Vero cells with avian reovirus (ARV) virulent strain S1133 and attenuated vaccine strain aS1133，respectively，two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectroscopy (MS) technologies were utilized to separate and identify the total proteins of Vero cells inoculated with ARV S1133 or aS1133 as well as control cells at desired time points post infection.The identification results showed that total 44 differently expressed protein dots were identified，including α-enolase，Prx-4，hnRNPs，tubulin，protein phosphatase，transcription elongation factor.These differentially expressed proteins were involved in various biological functions，including signaling transduction，cytoskeleton，metabolism，protein disfolding，cell proliferation and apoptosis.The results of quantitative RT-PCR validated the mRNA expression of α-enolase，Prx-4，hnRNPs and tubulin were in agreement with that of proteomic analysis.The present data highlighted protein expression differences in infected cells with ARV virulent strain and attenuated vaccine strain，which would contribute to further elucidate the interaction between ARV and hosts.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.016

收稿日期：2015-07-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31160512)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項(2011B020)；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項目(桂漁牧科201452003)

作者簡介：黃莉(1978-)，女，廣西南寧人，博士，主要從事禽病防治與病原分子生物學(xué)研究，Tel: 0771-3120371, E-mail: lhuang405@126.com *通信作者：謝芝勛(1963-)，研究員，主要從事畜禽傳染病分子生物學(xué)研究，E-mail: xiezhixun@126.com

中圖分類號：S852.659.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0331-09