胡　波，范志宇，王　芳，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，徐為中，薛家賓

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

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兔出血癥病毒衣殼蛋白P區(qū)二聚體的表達(dá)及其與受體結(jié)合能力分析

胡波，范志宇，王芳*，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，徐為中，薛家賓

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

摘要：為檢測兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白(VP60)P區(qū)形成二聚體的能力及其與HBGAs受體結(jié)合的能力，作者以pMD19T-VP60為模板擴(kuò)增包含鉸鏈區(qū)H的P區(qū)基因(HP)并克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得HP蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，結(jié)果顯示，HP蛋白主要以包涵體的形式高效表達(dá)，經(jīng)HisTrap親和柱純化后可形成二聚體結(jié)構(gòu)。通過HBGAs受體結(jié)合試驗表明，P區(qū)與完整病毒衣殼相似，能與唾液中的HBGAs受體發(fā)生結(jié)合。本研究為進(jìn)一步開展RHDV衣殼蛋白與受體的相互作用研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒；衣殼蛋白；P區(qū)；組織血型抗原；受體結(jié)合

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，該病在全世界范圍內(nèi)廣泛流行。RHDV屬杯狀病毒，無囊膜，為單股正鏈RNA病毒[1-2]。其含有兩個開放閱讀框(ORF)，衣殼蛋白VP60位于ORF1的3′端，基因長度為1 740 bp，編碼579個氨基酸，是病毒衣殼的最基本的單位，與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)[2]。180個VP60單體以二聚體的形式自聚成RHDV病毒樣顆粒(VLPs)[2-3]。據(jù)X射線晶體研究[3]報道，VP60主要分為三個區(qū)域：NTA(N端臂，1—65 aa)、框架區(qū)(S區(qū)，66—229 aa)、突出區(qū)(P區(qū)，238—579 aa)和連接S與P區(qū)的鉸鏈區(qū)(Hinge，230—237 aa)。S區(qū)形成VLPs的內(nèi)殼，P區(qū)位于VLPs的外表面，形成VLPs的刺突結(jié)構(gòu)[4]。P區(qū)是宿主抗體識別及靶向的主要區(qū)域，影響病毒的抗原性及病毒粒子與細(xì)胞受體的吸附作用，該區(qū)域序列具有較高的變異性[5-7]。

目前研究認(rèn)為，組織血型抗原(HBGAs)是RHDV的結(jié)合受體[2]。K.Nystr?m等[8]比較了各基因型RHDV與各型HBGAs結(jié)合的關(guān)系，認(rèn)為HBGAs是RHDV的結(jié)合因子，并促進(jìn)病毒的感染。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RHDV結(jié)合ABH組織血型抗原(HBGAs)，并能與合成的A型和H2型多糖發(fā)生特異性結(jié)合，且RHDV及其VLPs吸附成年兔呼吸道和消化道上皮細(xì)胞依賴于HBGAs的存在[8-9]。缺乏正確HBGAs配體的兔能夠抵抗低劑量RHDV的攻擊[8]。同屬于杯狀病毒的諾如病毒(NVs)與RHDV在晶體結(jié)構(gòu)上十分相似，NVs在侵染時也能夠特異性識別并結(jié)合HBGAs受體，其結(jié)合位點位于外表面的P二聚體或P亞區(qū)[10-13]，并通過唾液HBGAs結(jié)合試驗證實不同基因型NVs與不同型HBGAs具有多種結(jié)合模式[14]。本研究構(gòu)建表達(dá)含鉸鏈區(qū)H的VP60 P區(qū)域，對其能否形成二聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并進(jìn)一步分析其與受體HBGAs的結(jié)合能力，將為RHDV VLPs的結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pMD19-T-VP60由本實驗室構(gòu)建并保存[15]；表達(dá)載體pET-28a(+)由本實驗室保存；E.coliDH5α感受態(tài)、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑和工具酶

DNA Marker DL2000及DL15000、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、凝膠回收純化試劑盒等購自TaKaRa公司；Pfx 高保真酶購自Invitrogen公司，酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG(HRP-IgG)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自Sigma公司；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板購自南京賽研生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗VP60 P區(qū)單克隆抗體3D11由本實驗室制備并保存；H型HBGA唾液樣品由本實驗室鑒定并保存；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3兔出血癥病毒HP基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫RHDV中國皖阜株VP60序列(FJ794180，RHDVa型)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計合成一對擴(kuò)增HP基因的特異性引物，由Invitrogen公司合成，上游引物HP-F：5′-TCGCATATGTCCAGCAAAACTGTTGACTC-3′；下游引物HP-R：5′-GCCAAGCTTTCAGACAT-AAGAAAAGCC-3′。在上游引物的5′端引入NdeⅠ酶切位點，下游引物的5′端引入HindⅢ 酶切位點。以本實驗室構(gòu)建保存的質(zhì)粒pMD19-T-VP60為模板擴(kuò)增HP基因。反應(yīng)體系如下：50倍稀釋的模板 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，50 mmol·L-1MgSO42 μL，10 mmol·L-1上下游引物各1 μL，10×Pfx Buffer 5 μL，Pfx高保真酶0.4 μL，加ddH2O至總體積50 μL；然后執(zhí)行下列反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，30個循環(huán)；68 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，膠回收試劑盒純化后備用。

1.4重組表達(dá)載體pET-28a-HP的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒同時進(jìn)行NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，T4DNA連接酶16 ℃連接1 h后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定，獲得重組表達(dá)載體pET-28a-HP，并送Invitrogen公司測序。

1.5HP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-28a-HP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取單菌落接種到含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按1∶100體積比將培養(yǎng)物接種于含卡那霉素抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，12 000 r·min-1離心收集菌體，PBS重懸后冰浴超聲破碎，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.6HP蛋白的純化及Western blot鑒定

按“1.5”的方法大量誘導(dǎo)表達(dá)HP蛋白，經(jīng)超聲破碎后，以含8 mol·L-1尿素的包涵體溶解液溶解沉淀，并用HisTrap親和柱純化目的蛋白質(zhì)，具體操作按親和層析柱說明書進(jìn)行。將純化后的HP蛋白透析去除尿素，所得產(chǎn)物進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE。采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜，以針對VP60 P區(qū)的單抗3D11(1∶1 000稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗進(jìn)行反應(yīng)，ECL顯色觀察結(jié)果。

1.7HP蛋白與受體HBGAs結(jié)合試驗

利用已建立的HBGAs結(jié)合試驗方法(參考諾如病毒與HBGAs結(jié)合試驗[16]建立)驗證HP蛋白與受體HBGAs的結(jié)合。具體步驟：將含H型HBGA的唾液樣品以PBS(pH7.4)按1∶1 000稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜后以5%的脫脂乳封閉2 h，PBST洗滌后加入HP蛋白，37 ℃ 孵育1.5 h，同時設(shè)VLPs陽性對照(VP60[15])、陰性對照(pET28a空載體誘導(dǎo)蛋白)和空白對照(PBS)。單抗3D11(1∶2 000稀釋)和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)反應(yīng)后以TMBS底物顯色10～15 min，2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測定OD450 nm值。

2結(jié)果

2.1pET-28a-HP重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

通過PCR擴(kuò)增獲得兔出血癥病毒HP基因。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得大小約為1 053 bp的目的片段(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后定向插入經(jīng)相同酶切的pET-28a(+)載體中，經(jīng)雙酶切鑒定，獲得重組表達(dá)載體pET-28a-HP(圖2)，測序結(jié)果表明其為HP基因，與皖阜株序列相似性為100%。

2.2HP蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-HP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后，上清和沉淀的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在約37 ku處有一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小一致。表明重組HP蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，上清中幾乎不表達(dá)。經(jīng)HisTrap親和柱純化包涵體后，獲得較純凈的目的蛋白質(zhì)(圖3)。

2.3HP蛋白的鑒定

純化的HP蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，與還原HP樣品(+β巰基乙醇)相比，非還原HP樣品(-β巰基乙醇)在約74 ku處多出一條蛋白質(zhì)條帶(圖4的1、2條帶)，經(jīng)Western blot鑒定，結(jié)果顯示，37和74 ku處的蛋白質(zhì)均為HP蛋白(圖4的3、4條帶)，說明純化后的HP蛋白可形成二聚體結(jié)構(gòu)。2.4HP與HBGAs結(jié)合檢測

將HP蛋白做一系列梯度稀釋后進(jìn)行HBGAs結(jié)合試驗。結(jié)果顯示，隨著HP蛋白濃度的增加，HP蛋白與H型HBGAs結(jié)合反應(yīng)的OD450 nm值隨之增大，而陰性和空白對照的OD450 nm值均小于0.2，表明HP蛋白能夠與H型HBGAs發(fā)生結(jié)合(圖5)。

3討論

RHDV衣殼蛋白VP60可自聚成VLPs并具有受體結(jié)合能力[2]。根據(jù)VP60的基因型分析，RHDV可分為RHDV經(jīng)典型(G1-G5)、RHDVa型(G6)和RHDVb型(RHDV2)，且經(jīng)典型RHDV與RHDVa的相似性明顯高于RHDVb與前兩者的相似性[17-19]。中國流行株除國內(nèi)外首次暴發(fā)的毒株WX84外，均為RHDVa型[20]。RHDVa型毒株衣殼蛋白的S區(qū)高度保守，P區(qū)可進(jìn)一步分為P1亞區(qū)(238—286、450—466、484—579 aa)和P2亞區(qū)(287—449、467—483 aa)。P2亞區(qū)位于病毒衣殼表面，含有病毒株特異性抗原表位和紅細(xì)胞結(jié)合位點，其變異程度高于P1亞區(qū)[3]。

近年來研究認(rèn)為HBGAs是RHDV的結(jié)合受體，在宿主RHD感染中起重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)從感染兔肝提取物中的天然RHDV和重組病毒衣殼蛋白均發(fā)現(xiàn)能夠特異性地結(jié)合HBGAs多糖，并黏附于成年兔的上呼吸道、消化道上皮細(xì)胞[8-9]。之后通過核磁共振試驗證實了在RHDV與HBGAs結(jié)合中，HBGAs上的L-巖藻糖是RHDV-VLPs最小的識別結(jié)構(gòu)[21]。但RHDVa-VLPs上P區(qū)所形成的刺突結(jié)構(gòu)是否包含了與受體HBGAs結(jié)合的所有要素，以及P區(qū)上哪些氨基酸組成了HBGAs的結(jié)合域卻并不明確。由于同屬杯狀病毒的諾如病毒(NVs)受體也為HBGAs，因此X.Wang等[3]在通過冷凍電子顯微鏡和晶體學(xué)等方法解析了RHDVa型病毒的結(jié)構(gòu)后，將其與NVs晶體結(jié)構(gòu)尤其是受體結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)RHDVa不具有NVs上與HBGAs相互作用的結(jié)合域，兩者與HBGAs的結(jié)合方式完全不同，并推測病毒表面的腔洞樣結(jié)構(gòu)可能與受體結(jié)合有關(guān)。而在NVs受體研究中，不同基因型的NVs就能夠結(jié)合不同型的HBGAs受體，該結(jié)合與P2亞區(qū)的RGD/NGR樣結(jié)合域有關(guān)，但不同型的結(jié)合位點并不完全相同[14]，同時研究表明形成顆粒結(jié)構(gòu)的P蛋白比P二聚體及單體具有更強(qiáng)的受體結(jié)合能力[22]。在RHDVb型病毒的研究中，M.M.Leuthold等[23]通過X射線晶體學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，HBGAs結(jié)合于RHDVb型病毒表面P區(qū)所形成的二聚體的交界面處，且P區(qū)的幾個保守位點與結(jié)合密切相關(guān)。由于RHDVb所具有的獨特的基因型和抗原性，且RHDVb衣殼蛋白基因與經(jīng)典型RHDV和RHDVa的相似性甚至低于兔杯狀病毒(RCV)與后兩者之間的相似性，因此也有學(xué)者認(rèn)為RHDVb不屬于RHDV的突變株，而是一種新發(fā)現(xiàn)的兔病毒[19]。由此推測，RHDVa P蛋白有形成多聚體的可能，且RHDVa和RHDVb與受體HBGAs的結(jié)合模式可能不同。為研究RHDVa表面氨基酸與受體HBGAs的結(jié)合域，RHDVa病毒衣殼蛋白外表面的P區(qū)是最佳對象。

本研究選擇皖阜株RHDV(RHDVa型)作為代表研究RHDVa與HBGAs的結(jié)合。采用pET28a(+)表達(dá)載體和NdeⅠ、HindⅢ插入位點以保證所表達(dá)的HP蛋白上除His標(biāo)簽和thrombin裂解位點外，無其他外源氨基酸。經(jīng)Western blot檢測表明，包含鉸鏈區(qū)H的P蛋白可以形成二聚體結(jié)構(gòu)。結(jié)合試驗證實，P區(qū)與完整病毒衣殼相似，能與H型HBGA發(fā)生結(jié)合。這表明RHDVa衣殼蛋白形成的VLPs結(jié)構(gòu)對于HBGAs受體的結(jié)合是非必需的，且P區(qū)中包含受體結(jié)合中必不可少的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特征。但P區(qū)二聚體的形成是否增強(qiáng)了P蛋白與受體HBGAs的結(jié)合力尚有待進(jìn)一步研究。以上結(jié)果表明所表達(dá)的P區(qū)的結(jié)構(gòu)特征對于RHDV衣殼蛋白與HBGAs受體的相互作用的研究具有重要意義，原核表達(dá)的P區(qū)可作為病毒與受體相互作用研究的模型。

4結(jié)論

成功構(gòu)建兔出血癥病毒HP基因的表達(dá)質(zhì)粒，并驗證HP蛋白的表達(dá)，證實包含鉸鏈區(qū)H的P蛋白能形成二聚體結(jié)構(gòu)。HBGAs受體結(jié)合試驗證明HP蛋白與完整VLPs相似，能與唾液中的HBGAs受體發(fā)生結(jié)合。這表明HP蛋白可替代VLPs作為研究受體結(jié)合的模型。

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(編輯白永平)

Expression of the P Dimer of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein and Analysis of Its Binding Ability to Receptor

HU Bo，F(xiàn)AN Zhi-yu，WANG Fang*，WEI Hou-jun，SONG Yan-hua，QIU Ru-long，XU Wei-zhong，XUE Jia-bin

(InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，Nanjing210014，China)

Key words:RHDV；capsid protein；P domain；HBGAs；receptor binding

Abstract:Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) is a member of theCaliciviridaefamily (Lagovirusgenus).Similar to human norovirus (Caliciviridae，Norovirusgenus)，RHDV binds histo-blood group antigens (HBGAs) and this is thought to be important for infection.The aim of this study was to determine whether the P domain of RHDV capsid protein (VP60) could form dimers and to analyze its binding ability to HBGAs receptor.The P domain gene containing hinge (HP) was amplified and cloned into pET-28a (+) expression vector and introduced intoEscherichiacoliBL21 (DE3).The recombinant HP protein，confirmed by SDS-PAGE and Western blot，was effectively expressed in form of inclusion bodies by inducing with IPTG.The recombinant protein was then purified with HisTrap affinity chromatography，which could form dimers after purification.The HBGAs binding assay showed that the P domain bound H type HBGA with the same patterns as those of the intact viral capsids.Further structural studies with P domain are needed in order to better understand the HBGA binding mechanisms and virus-receptor interaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.015

收稿日期：2015-06-20

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-44)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX (13) 5029]

作者簡介：胡波(1982- )，男，江蘇南京人，助理研究員，碩士，主要從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術(shù)研究，Tel：025-84390337，E-mail：hadisi2002@163.com *通信作者：王芳，研究員，E-mail：rwangfang@126.com

中圖分類號：S858.291；S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0325-06