劉　然，張惠子，云皓琪，陳　陽，2，黃正洋，2，張　揚，2，徐　琪，2，陳國宏，2*

(1.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009； 2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚州 225009)

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miRNA-34基因家族進(jìn)化分析及其在鵝生殖周期內(nèi)的表達(dá)變化

劉然1，2#，張惠子1#，云皓琪1，陳陽1，2，黃正洋1，2，張揚1，2，徐琪1，2，陳國宏1，2*

(1.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009； 2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚州 225009)

摘要：旨在探明miRNA-34基因家族(miRNA-34s)系統(tǒng)進(jìn)化歷程及其在鵝生殖周期內(nèi)的表達(dá)變化規(guī)律。通過文獻(xiàn)和miRBase數(shù)據(jù)庫檢索脊椎動物的miRNA-34s序列，利用Ensembl數(shù)據(jù)庫信息，確定miRNA-34s在基因組中的位置，采用MEGA 6.0構(gòu)建miRNA-34s的系統(tǒng)進(jìn)化樹；并利用RT-qPCR檢測鵝卵巢組織miRNA-34s在生殖周期內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果在脊椎動物中共搜索70余條miRNA-34s序列，miRNA-34s 3個成員(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在脊椎動物中分布廣泛，高度保守，均位于基因間隔區(qū)(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34b和miRNA-34c兩個基因位于同一染色體上，在進(jìn)化過程中緊密相連，可能是由于串聯(lián)重復(fù)所致。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-34s 3個成員在鵝的開產(chǎn)前期、排卵期、排卵后期和就巢期卵巢組織中表現(xiàn)出相同趨勢的表達(dá)，即在排卵期、排卵后期表達(dá)水平高于或顯著高于開產(chǎn)前期和就巢期。miRNA-34家族在進(jìn)化中高度保守，且在調(diào)控鵝生殖周期中發(fā)揮一定的作用。

關(guān)鍵詞：鵝；miRNA-34；進(jìn)化；定量表達(dá)

microRNA(miRNA)作為廣泛影響基因表達(dá)的潛在調(diào)控因子，在真核細(xì)胞中具有高度的保守性。miRNA在細(xì)胞生長、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及病理過程中起重要作用。miRNA主要通過結(jié)合目的mRNA的3′非編碼區(qū)域的互補序列來發(fā)揮作用，并通過加速轉(zhuǎn)錄的進(jìn)程來抑制基因表達(dá)，或通過與多蛋白RISC的相互作用來抑制翻譯進(jìn)程[1]。不同物種間的同源miRNA存在高度進(jìn)化保守性，如miRNA-l、miRNA-34、miRNA-87在無脊椎動物和脊椎動物中高度保守，序列比對分析發(fā)現(xiàn)這些保守序列的堿基差異僅為1～2 nt[2]。miRNA在物種間的保守性使其成為探索非編碼RNA進(jìn)化規(guī)律的理想分子。

miRNA-34家族包括3種miRNA(a/b/c)，它們包含相同的種子區(qū)域，具有高度保守性。這種保守性與其功能有著密切關(guān)系。研究顯示，miRNA-34家族成員在配子形成和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[3-5]。A.Tscherner等[6]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34s主要作用于牛配子形成時期，且在精子中miRNA-34s有獨特的表達(dá)特征，可以作為雄性的生產(chǎn)力指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34a和miRNA-34b在多種組織中廣泛表達(dá)[7-8]，但miRNA-34c僅在生殖腺等組織中檢測到[9]。王勃[10]通過RT-qPCR技術(shù)比較miRNA-34c在牛胎兒成纖維細(xì)胞、精子、MII期卵母細(xì)胞中表達(dá)，確定miRNA-34c在精子中表達(dá)量較高，而在體細(xì)胞、卵母細(xì)胞中的相對表達(dá)量非常低。精子中所攜載的miRNA-34c可以通過誘導(dǎo)表達(dá)的形式賦予供體細(xì)胞，能提高胚胎發(fā)育能力、核重編程及胚胎質(zhì)量。精子miRNA-34c表達(dá)水平可能會影響卵裂期的胚胎質(zhì)量，對卵裂期的胚胎發(fā)育起到一定的積極作用[11]。本課題組前期以浙東白鵝為研究對象，采用Solexa深度測序產(chǎn)蛋和就巢組鵝卵巢miRNA的轉(zhuǎn)錄組，用生物信息學(xué)來確定miRNA的差異表達(dá)。鑒定1 328條已知的保守miRNA和22個新的潛在候選miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA-34家族在產(chǎn)蛋鵝和就巢鵝之間表達(dá)差異達(dá)到顯著水平[12]。綜上表明，miRNA-34家族與生殖調(diào)控關(guān)系密切，且與配子生成有關(guān)。

鑒于miRNA-34s與生殖調(diào)控及配子生成密切相關(guān)，在前期研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探明miRNA-34s進(jìn)化分析及其在鵝生殖周期內(nèi)的表達(dá)變化，本研究利用Ensembl數(shù)據(jù)庫信息，比對幾種常見禽類miRNA-34s前體序列，確定miRNA-34s在基因組中的位置，構(gòu)建miRNA-34s系統(tǒng)進(jìn)化樹；并利用RT-qPCR檢測鵝卵巢組織miRNA-34s的表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步揭示鵝miRNA-34s在生殖調(diào)控中作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1miRNA-34序列的獲得

從miRBase(http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl) 中下載獲得25種脊椎動物的miRNA-34基因成熟序列及前體序列，并從已報道文獻(xiàn)中獲得鴨和鵝的miRNA-34基因成熟序列[12-13]，其前體序列從鴨、鵝genome assembly scaffolds BLAST獲得。

1.2幾種常見禽類的miRNA-34s基因定位

采用Ensembl數(shù)據(jù)庫BLAST(http：//asia.ensembl.org/index.html)程序，分別用家雞、家鴨、家鵝、斑胸草雀等4個禽類(以人、小鼠)的miRNA-34前體序列對其基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以確定miRNA-34s在基因組中的位置。

1.3miRNA-34s系統(tǒng)發(fā)生分析

選擇21種脊椎動物和無脊椎動物中每個種屬中代表性物種，采用Clustal W軟件對其miRNA-34基因的前體序列進(jìn)行多序列比對分析(Multiple sequences alignment，MSA)，利用MEGA 6.0軟件采用基于距離參數(shù)的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)，并自展分析(Bootstrap) 1 000次，構(gòu)建miRNA-34s的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4miRNA-34s在鵝生殖周期內(nèi)的定量表達(dá)檢測

鵝的生殖周期分段明顯，包含產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋期(就巢期)和休產(chǎn)期等幾個階段。鵝150日齡開產(chǎn)，產(chǎn)蛋一段時間后，體溫升高，被毛蓬松，抱蛋而窩，停止產(chǎn)蛋即進(jìn)入就巢期。本試驗采用miRcute miRNA Isolation Kit (TIANGEN，China，DP501)分別提取開產(chǎn)前期(120日齡)、產(chǎn)蛋期(380日齡，排卵前)、產(chǎn)蛋期(380日齡，排卵后)和就巢期(380日齡)浙東白鵝母鵝卵巢基質(zhì)的sRNA，取3 μL sRNA，采用Poly(A)加尾法進(jìn)行RT-PCR，具體操作按miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis kit (Tiangen)試劑盒說明書進(jìn)行。采用SYBR Green qPCR 法檢測miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c的表達(dá)量，擴增引物見表1，PCR擴增采用兩步法，PCR反應(yīng)條件參照miRcute miRNA qPCR detection kit試劑盒說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500 熒光定量 PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，U6作為內(nèi)參，每個樣本重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt計算miRNA相對表達(dá)量(以開產(chǎn)前期卵巢組織為對照)。各時期表達(dá)量差異采用獨立樣本t檢驗(Independent-samplesttest)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1miRNA-34s RT-qPCR擴增引物

Table 1Sequence of the oligonucleotide primers of RT-qPCR

2結(jié)果

2.1miRNA-34s及其在基因組中的定位

根據(jù)文獻(xiàn)[12-14]和miRBase檢索共搜索27種脊椎動物70余條miRNA-34s序列，其中人類(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和雞(Gallusgallus)等18種脊椎動物都具有miRNA-34s 3個成員(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)；絨毛猴(Lagothrixlagotricha)、蜘蛛猴(Atelesgeoffroyi)和平頂猴(Macacanemestrina)僅檢索到miRNA-34a；樹鼩(Tupaiachinensis)和熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)擁有miRNA-34a和miRNA-34b，且發(fā)現(xiàn)熱帶爪蟾存在xtr-miRNA-34b、xtr-miRNA-34b-1、xtr-miRNA-34b-2、xtr-miRNA-34b-3和xtr-miRNA-34b-4 同源序列；鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)和豬(Susscrofa)擁有miRNA-34a和miRNA-34c。

以家雞、家鴨、家鵝、斑胸草雀4個禽類(以人、小鼠)的miRNA-34前體作為查詢序列(Query sequence)，分別對其相關(guān)基因組進(jìn)行BLAST 搜索，確定各序列在基因組中的位置(表2)，基因定位顯示，與其它哺乳動物miRNA主要定位在內(nèi)含子區(qū)域不同的是，禽類miRNA-34s家族3個成員均位于基因間隔區(qū)(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34a和miRNA-34b兩個基因位于同一染色體上。

2.2miRNA-34s序列分析

對14種典型物種的miRNA-34s的成熟序列進(jìn)行多序列比對分析(圖1)，結(jié)果顯示，miRNA-34s的成熟序列同源性很高，序列長度(22～23 nt)相近，保守堿基17個，分別為第3～10位、14～20位以及22～24位堿基，說明miRNA-34s在不同物種間的高度保守性。比對結(jié)果顯示，miRNA-34s在其進(jìn)化過程中可能發(fā)生了缺失，有的物種在第1位、25位和26位缺失了堿基U/C，大多數(shù)物種在第13位缺失了堿基A/G；在第12和21位堿基分別出現(xiàn)A>C和A>G。

2.3miRNA-34s系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

來源于miRBase中miRNA-34基因主要分布在脊椎動物哺乳綱、鳥綱、兩棲綱以及無脊椎動物的昆蟲綱和線蟲綱等，采用MEGA 6.0軟件，以這些綱目中的代表性物種miRNA-34s序列構(gòu)建基于距離參數(shù)的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)。由圖2可以看出，進(jìn)化樹大致可分為兩支：miRNA-34b和 miRNA-34c位于第一分支中，這一分支中只有一個例外是spu-miRNA-34，另一分支為 miRNA-34/miRNA-34a。從進(jìn)化樹的分支和距離上看，miRNA-34a基因的分支出現(xiàn)在進(jìn)化早期，并且一直延續(xù)到現(xiàn)在，因而它很可能是miRNA-34 基因家族中最早出現(xiàn)的基因形式，即祖先基因。在無脊椎動物中，miRNA-34 基因只有一個拷貝(miRNA-34)，而在脊椎動物中 miRNA-34 基因一般都有3種形式 (miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)，且miRNA-34基因家族的3個成員穩(wěn)定地存在于從魚類到哺乳動物中。

2.4miRNA-34s在鵝生殖周期內(nèi)的定量表達(dá)檢測

采用RT-qPCR對開產(chǎn)前期、產(chǎn)蛋期(排卵)、產(chǎn)蛋期(排卵后)和就巢期鵝卵巢基質(zhì)miRNA-34家族成員進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c在鵝卵巢組織中均有表達(dá)，且開產(chǎn)前期、排卵期、排卵后期和就巢期呈現(xiàn)一定規(guī)律表達(dá)，即在排卵期、排卵后期表達(dá)水平高于或顯著高于開產(chǎn)前期和就巢期。

表2miR-34s在基因組中的定位

Table 2Genomic location of miR-34 gene family

3討論

microRNA作為重要的內(nèi)源性調(diào)控基因，分布范圍廣，參與多種生物學(xué)調(diào)控過程[15]。miRNA-34s在脊椎動物中分布廣泛，且高度保守，但在無脊椎動物和脊椎動物中miRNA-34s成員數(shù)并不相同，在漫長的進(jìn)化過程中，3個成員組成的miRNA-34 基因家族保守地存在于幾乎所有的脊椎動物中，這是否意味著與無脊椎動物相比，脊椎動物需要更多的miRNA-34 基因來形成一個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而成功的行使其調(diào)控功能。對miRNA-34s的進(jìn)化分析顯示，miRNA-34a基因主要出現(xiàn)在進(jìn)化早期，為祖先基因，且miRNA-34b和mir-34c基因親緣關(guān)系很近，且位于同一染色體上聚集成簇，暗示它們在進(jìn)化過程中緊密相連，這可能在miRNA-34基因進(jìn)化過程中出現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)所致。J.Hertel等[16]在后生動物基因組miRNA基因家族之間的系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示了串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)是miRNA基因簇進(jìn)化的主要機制，也因此產(chǎn)生miRNA基因簇和miRNA基因家族的多樣性分布。作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控元件，miRNA成熟序列5′端 的第2～8位堿基對于其功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要，被稱為種子序列(Seed sequence)[2]。Blast結(jié)果顯示，不同物種的miRNA-34s種子序列保守性為100%，暗示其功能的保守性。本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA-34s成員在鵝的開產(chǎn)前期、排卵期、排卵后期和就巢期表現(xiàn)出相同趨勢的表達(dá)。miRNA-34家族成員在不同生殖時期的表達(dá)變化較大。這提示miRNA-34家族在調(diào)控鵝生殖周期中發(fā)揮重要作用。有報道m(xù)iRNA-34家族的成員 (miRNA-34a/b/c)是p53作用的直接靶點[15]。miRNA-34s在小鼠睪丸等組織的高表達(dá)在很大程度上依賴p53在這些組織中的表達(dá)，并在p53通路中的存在其他作用。在鵝的生殖周期調(diào)控中，受生殖激素水平的制約，如孕酮(P4)，開產(chǎn)前P4慢慢上升，并在產(chǎn)蛋高峰期維持高水平，就巢期最低，且排卵周期內(nèi)P4在產(chǎn)蛋前13 h內(nèi)分別出現(xiàn)兩次高峰[17]。這一結(jié)果與本研究miRNA-34s在在不同生殖時期的表達(dá)變化規(guī)律一致。孕酮能上調(diào)卵巢細(xì)胞的p53表達(dá)[18]；筆者推測miRNA-34家族成員在不同生殖時期的表達(dá)變化仍依賴p53表達(dá)。

4結(jié)論

4.1miRNA-34家族3個成員(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在脊椎動物中分布廣泛，且高度保守；均位于基因間隔區(qū)(Intergenic region，IGR )，且miRNA-34b和miRNA-34c兩個基因位于同一染色體上，在進(jìn)化過程中緊密相連，可能是由于串聯(lián)重復(fù)所致。

4.2RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-34s成員(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在鵝的開產(chǎn)前期、排卵期、排卵后期和就巢期卵巢組織中表現(xiàn)出相同趨勢的表達(dá)，即在排卵期、排卵后期表達(dá)水平高于或顯著高于開產(chǎn)前期和就巢期。

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(編輯程金華)

Molecular Evolution Analyzing of miRNA-34 Gene Family and Its Expression in Goose Reprodutive Cycle

LIU Ran1，2#，ZHANG Hui-zi1#，YUN Hao-qi1，CHEN Yang1，2，HUANG Zheng-yang1，2，ZHANG Yang1，2，XU Qi1，2，CHEN Guo-hong1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuKeyLaboratoryofAnimalGenetics&BreedingandMolecularDesign，Yangzhou225009，China)

Key words:goose；miRNA-34；evolution；quantitative expression

Abstract:This experiment was conducted to investigate the miRNA-34 gene family evolutionary process and its expression regularity in goose reproductive cycle.The miRNA-34 genes were searched in literatures and miRBase.It’s genes were located by Ensemble database，and its phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0.In addition，the expression level of miRNA-34s was detected in ovarian tissue of goose reproductive cycle using RT-qPCR.A total 70 sequences in 27 species which indicated the extensive existence of miRNA-34s(miRNA-34a，miRNA-34b and miRNA-34c) in different species.The analysis of gene localization showed all miRNA-34 genes were located on the intergenic region(IGR).miRNA-34b and miRNA-34c shared on the same chromosome and they were closely linked in evolutionary process，which maybe caused by tandem repeats.Besides，the similar expression of miRNA-34s were detected in goose ovary tissues of pre-laying stage，ovulation，oviposition，and the broody phase.More miRNA-34s expression was detected at ovulation，oviposition than that in pre-laying and broody phase period.The miRNA-34s are highly conservative in evolution process，and play a role in regulation reproductive activity in goose.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.007

收稿日期：2015-06-10

基金項目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201411117050Y)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項CARS-43-3)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(蘇政辦發(fā)[2011]137號)

作者簡介：劉然(1990-)，女，山東濟寧人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail:betterlr@163.com；張惠子(1993-)，女，江蘇連云港人，本科生，主要從事動物科學(xué)研究，E-mail：15396752381@163.com。劉然和張惠子為并列第1作者 *通信作者：陳國宏，E-mail：ghchen@yzu.edu.cn

中圖分類號：S835.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0260-08