曾　芳，李紫聰，董　銳，吳珍芳，王　翀

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣州 510642)

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轉基因豬技術及其在農(nóng)業(yè)上的應用

曾芳，李紫聰，董銳，吳珍芳，王翀*

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣州 510642)

摘要：轉基因豬技術不僅可用于豬的育種，還可應用于生物醫(yī)藥領域。該技術對養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)水平的提高和人類健康的改善均有重要的應用價值。本文從轉基因豬制備所需的顯微操作技術和介導外源基因整合方法兩方面對轉基因豬技術的研究進展進行綜述，并簡要概括轉基因豬技術在農(nóng)業(yè)領域的應用現(xiàn)狀。

關鍵詞：豬；轉基因；顯微注射；基因打靶

豬是重要的經(jīng)濟動物，同時也是現(xiàn)代醫(yī)學研究常用的大型模式動物。自世界第一例轉基因豬問世以來，轉基因豬技術發(fā)展迅速，在豬品種改良、人類疾病動物模型的建立、異種器官移植供體和藥物蛋白生物反應器等方面的研究均取得長足的進展。本文主要介紹顯微操作技術和介導外源基因整合方法制備轉基因豬的關鍵技術方面的研究進展，并對轉基因豬技術在農(nóng)業(yè)方面的應用進行簡要綜述。

1轉基因豬技術的研究現(xiàn)狀

轉基因豬制備的效率及操作難度主要由兩個方面決定：一方面是制備轉基因豬所用的顯微操作技術，主要包括原核顯微注射(Pronuclear microinjection，PNI)、胞漿注射(Cytoplasmic injection，CI)、體細胞克隆(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)、胞漿單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)；另一方面是制備轉基因豬時用于介導外源基因整合的方法，主要包括普通線性化質粒介導、病毒載體介導、轉座系統(tǒng)載體介導以及人工核酸酶介導。人工核酸酶主要包括可對基因進行定點編輯的ZFN(Zinc finger nuclease)、TALEN(Transcription activator-like effecter nucleases)、CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/Cas9 nuclease)。

1.1用于制備轉基因豬的顯微操作技術

原核顯微注射是制備轉基因動物的常用方法。該方法是采用極細的玻璃微量注射針，將外源DNA直接注射到受精卵原核中，再通過胚胎移植技術將含外源DNA的胚胎移植到代孕動物的子宮內(nèi)發(fā)育，從而獲得轉基因動物。1985年，R.E.Hammer等[1]采用PNI生產(chǎn)出世界上第1頭轉基因豬。隨后三十年，科學家利用原核顯微注射法成功生產(chǎn)出各種轉基因豬。PNI在轉基因豬上應用很成功，但由于PNI操作要求精細、費用高且制備轉基因豬的效率較低，通常在1%(轉基因豬數(shù)/移植的注射胚胎數(shù))左右[2]，其應用受到一定限制。

胞漿注射是指利用微量注射針將DNA直接注射到受精卵胞漿內(nèi)。豬受精卵含有大量脂肪顆粒，透明度不佳，如進行原核注射通常需對其離心才能看到雄原核。采用胞漿DNA注射法可避免離心對豬受精卵造成的物理損傷，并且胞漿的空間比雄原核要大得多，在操作上較原核顯微注射法更簡單。2011年，W.Garrels等[3]將含綠色熒光蛋白(GFP)基因的轉座子質粒(Sleeping beauty，SB)注射至豬受精卵胞漿生產(chǎn)出轉基因豬，證明采用胞漿注射法生產(chǎn)轉基因豬的可行性。2013年，本研究團隊采用piggyBac(PB)轉座系統(tǒng)結合胞漿注射法高效制備出轉基因豬，其效率達8.0%(轉基因豬數(shù)/移植的注射胚胎數(shù))，并通過對比試驗優(yōu)化得到最佳的注射時間、注射劑量等[4]，為進一步采用胞漿注射法制備其他轉基因豬提供可用的技術參數(shù)。

體細胞核移植也即克隆技術，克隆羊Dolly的出生標志著哺乳動物SCNT的誕生[5]。利用SCNT生產(chǎn)轉基因動物的過程是首先將外源DNA轉染體外培養(yǎng)的體細胞，然后篩選出轉基因體細胞作為核供體，將轉基因體細胞核移入去核卵母細胞中再通過胚胎移植獲得轉基因動物，該方法可確保原代全部是轉基因動物，減少轉基因動物建系時間，且所需動物數(shù)量比原核顯微注射法大幅度降低。采用SCNT生產(chǎn)轉基因豬的效率仍然較低，其主要原因可能與克隆胚胎通常存在發(fā)育缺陷，僅小部分可以存活到出生有關[6-8]。近年來研究人員通過改進卵母細胞的培養(yǎng)體系、激活條件，采用不同豬品種、不同年齡、不同組織來源細胞作為核供體等途徑嘗試提高SCNT制備轉基因豬的效率[9-11]。另外，通常制備多基因整合轉基因豬需經(jīng)過多頭轉單基因豬相互配種的復雜程序，為簡化這一復雜過程，研究人員進行同時轉多個基因策略的探索。2011年，W.Deng等[12]利用2A短肽序列將不同的熒光蛋白基因克隆在同一個載體，僅通過一個SCNT操作周期即成功獲得含多個轉基因的克隆豬，實現(xiàn)多基因的共表達。

胞漿單精子注射法是與精子載體法(Sperm-mediated gene transfer，SMGT)結合起來可用于生產(chǎn)轉基因動物的一種顯微操作技術，其過程是將與外源DNA共孵育后的單個精子注射到卵母細胞胞漿內(nèi)，再將其移植到代孕動物子宮使之發(fā)育成個體，最終獲得轉基因動物。2012年，K.Umeyama等[13]采用PNI和ICSI制備獲得的轉基因豬胚胎中轉基因的表達研究，結果發(fā)現(xiàn)PNI組僅10%桑椹胚顯示轉GFP基因陽性，而ICSI組有61.5%桑椹胚顯示轉GFP基因陽性，且ICSI組出生豬中有25%是轉GFP基因豬，表明采用ICSI制備轉基因豬的可行性及其可能存在的技術優(yōu)勢。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)ICSI組轉基因大部分呈多拷貝單位點插入，該模式有利于建立穩(wěn)定表達的轉基因動物家系，因此這項研究成果或將促使ICSI成為制備轉基因豬的優(yōu)選技術之一。

1.2用于介導外源基因整合的技術

轉基因豬的制備效率不但受所用的顯微操作技術影響，還受所用的介導外源基因整合方法的影響。在最早的轉基因豬研究中，一般是以線性化的普通質粒為載體介導外源基因整合，具體操作是將攜帶外源基因的線性化普通質粒注射到受精卵的雄原核，或在體細胞核移植前轉染供體細胞。這種介導外源基因整合的方法操作相對簡單，但由于外源基因通常僅在宿主基因組DNA發(fā)生斷裂修復時才能整合到宿主基因組中，因此外源基因整合效率極低，約為10-5～10-6。利用病毒載體介導外源基因整合在宿主基因組的效率比普通線性化載體顯著提高，但由于病毒載體可能引起生物安全問題，其應用范圍受到極大限制。隨著轉座子被發(fā)現(xiàn)，特別是PB和SB轉座子的高轉座活性被證明之后，轉座系統(tǒng)在哺乳動物上的應用研究受到關注。W.Garrels等[3]和Z.Wu等[14]分別采用SB轉座系統(tǒng)和PB轉座系統(tǒng)介導基因整合方法高效生產(chǎn)轉基因豬。采用SB、PB轉座系統(tǒng)制備轉基因豬的效率較高，但該技術仍然存在轉基因隨機整合的缺陷。

近年來，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技術的建立，實現(xiàn)了基因的靶向修飾，使轉基因技術研究邁向新的臺階。ZFN是由具有特異DNA識別功能的鋅指蛋白結構域和具有DNA切割功能的FokI內(nèi)切酶結構域兩部分組成。人們可針對目的基因設計合成相應的ZFN，使其在細胞內(nèi)靶向切斷基因組DNA雙鏈，再通過DNA非同源末端連接修復機制敲除目的基因或DNA同源重組修復機制引入外源基因。F.D.Urnov等[15]首次利用ZFN技術對體外培養(yǎng)細胞進行IL2Rγ基因修復，在未經(jīng)藥物篩選情況下，修復細胞達18%。TALEN除DNA識別結構域與ZFN不同以外，其結構和作用機制均與ZFN相同。TALEN首先特異識別并定位至靶位點，形成二聚體后，在左、右靶位點的中間區(qū)域發(fā)揮內(nèi)切酶活性切斷DNA雙鏈，從而誘發(fā)DNA損傷修復機制使基因敲除或敲入[16]。

CRISPR/Cas9技術是2013年初才發(fā)展起來的基因打靶新技術。CRISPR/Cas9由規(guī)律成簇間隔短回文重復CRISPR和Cas9核酸酶組成，CRISPR識別特定序列，Cas9核酸酶負責切割。L.Cong等[17]最早利用細菌RNA引導Cas9核酸酶在小鼠和人類細胞基因組的特定基因位點上進行了精確切割。P.Mali等[18]利用CRISPR/Cas9技術，在幾種不同的人類細胞中，對AAVS 1位點進行靶向酶切后進行同源重組修復或非同源重組末端連接修復，發(fā)現(xiàn)其打靶效率在293T細胞、K562細胞以及誘導性多能干細胞分別為10%～25%、8%～13%、2%～4%，與ZFN、TALEN技術相當。

ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技術的基因定點修飾特性，近年來用于異種移植的GGTA1基因敲除豬、PARK2和PINK1雙基因敲除豬、MHC-Ⅰ基因敲除豬[19-22]陸續(xù)被報道。然而，該技術在豬上進行基因敲入研究較少，其可能原因在于基因敲入的實現(xiàn)受更多技術因素制約，如轉基因載體的構建，其中包括同源臂的長度、載體的大小等都將直接影響轉基因的整合效率，還有轉基因插入位點的選擇，與轉基因最終能否在宿主表達密切相關。因此，從影響基因敲入的各技術因素入手，進行轉基因體系的優(yōu)化，特別是轉基因載體的選擇、豬基因組上合適插入位點的確定，將有助于這些技術今后在定點修飾轉基因豬制備方面的應用。

2轉基因豬技術在農(nóng)業(yè)上的應用

2.1生長性能或肉質改良的轉基因豬

隨著經(jīng)濟增長和生活水平的提高，人們對豬肉量的需求快速增長，對肉品質的要求也大大提高，提高豬的生長性能和肉品質成為豬遺傳育種工作者的首要任務之一。轉基因育種是實現(xiàn)豬產(chǎn)肉量快速增長和肉品質改善的重要途徑。目前涉及該方面的轉基因豬研究如表1所列，早期研究多以提高豬肉產(chǎn)量為目的，以生長軸的3大激素：生長激素、類胰島素生長因子、生長激素釋放因子為研究對象生產(chǎn)出各種轉基因豬。其中，調控機體生長的核心激素——生長激素是最受關注的，為達到促動物生長的最佳效果，人們在生長激素基因表達的時間和空間上進行研究。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展逐漸滿足人類對豬肉量的需求，人們轉向注重豬肉品質的提升，科學研究也從提高豬肉產(chǎn)量轉變?yōu)楦纳曝i肉品質。由于豬肉中飽和脂肪酸含量高，攝入過多飽和脂肪酸會引起高血脂、高膽固醇等疾病，相比之下，不飽和脂肪酸更利于健康。K.Saeki等[23]首次生產(chǎn)不飽和脂肪酸比普通豬高約20%的轉菠菜脂肪酸脫氫酶基因豬。此后，科學家又研制出轉線蟲多不飽和脂肪酸脫氫酶基因豬，其中部分轉多不飽和脂肪酸脫氫酶基因豬ω-3不飽和脂肪酸含量豐富[24-25]。2.2抗病轉基因豬

發(fā)展健康養(yǎng)殖業(yè)是21世紀國民經(jīng)濟和社會發(fā)展的重大戰(zhàn)略需求，但豬病頻發(fā)不僅給養(yǎng)殖業(yè)本身帶來極大經(jīng)濟損失，由此產(chǎn)生的抗生素藥物殘留引起的環(huán)境污染和食品安全等問題極大地阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。培育抗病力強的新品種，從遺傳本質上提高豬對疾病病原的免疫力，減少抗生素的使用，對促進養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展乃至人類健康和環(huán)境保護都具有重要的研究意義和應用價值。自20世紀90年代，研究人員就已開始轉基因抗病育種研究。如表2所列，抗病轉基因研究策略大致可歸納為兩種：(1)直接轉入抗病基因，如抗粘液病毒基因；(2)基于RNA干擾技術的抗病研究，如轉入可抑制病毒復制的小干擾RNA表達質粒。中國作為養(yǎng)豬生產(chǎn)大國，畜牧工作者將豬的抗病育種研究視為工作重點，并在該研究領域獲得一定成果。王鐵東[33]培育出抗豬瘟病毒的轉基因克隆豬；隨后，J.Tong等培育出轉人溶菌酶基因豬，并證明該轉基因豬乳汁中表達的人溶菌酶可抗小豬腹瀉[34-35]。Q.Yan等利用體細胞核移植技術制備轉豬抗粘液病毒基因的克隆豬，并在體外驗證了該轉基因豬的耳成纖維細胞比非轉基因對照組成纖維細胞具有更好的抗豬瘟病毒能力[36]。

表1生長性能或肉質改良的轉基因豬研究現(xiàn)狀

Table 1Current research status of transgenic pig for growth and quality improvement

表2抗病轉基因豬研究現(xiàn)狀

Table 2Current research status of transgenic pig for disease resistance

2.3環(huán)保轉基因豬

近年來，養(yǎng)殖業(yè)引起的環(huán)境污染問題已引起全世界的高度關注，其中集約化生產(chǎn)高度集中、養(yǎng)殖量巨大的養(yǎng)豬業(yè)是環(huán)境污染的主要來源之一。氮、磷是豬糞尿的主要污染物成分，同時也是飼料中重要營養(yǎng)成分，如能提高氮、磷的生物利用率，不但可節(jié)約飼料成本，且能明顯減少糞尿中氮磷污染物及臭氣的排放，減少環(huán)境污染。S.P.Golovan等[42-43]首次采用原核顯微注法生產(chǎn)了轉植酸酶基因豬，該轉基因豬在唾液中表達的植酸酶可提高豬對植酸磷的消化率，從而減少豬排泄物中的磷含量。張獻偉等[44]培育出共表達葡聚糖酶、木聚糖酶及植酸酶的轉基因豬，這些轉基因豬對飼料蛋白、磷等營養(yǎng)物質的利用率顯著提高，且其排泄物中磷、氮等污染物排放顯著減少。Y.S.Lin等[45]研究培育出豬胰腺特異啟動子控制的轉真菌纖維素酶基因豬，該轉基因豬有望提高豬對飼料中纖維素的利用率，減少糞中污染物的排放。

3展望

隨著生物技術的不斷發(fā)展，顯微操作技術以及介導基因整合方法的建立與改進，實現(xiàn)了轉基因豬的制備。特別是體細胞核移植技術在豬上的成功建立，大大促進轉基因豬的研發(fā)應用，研究人員利用該技術培育出各種對未來養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展具有重要價值的轉基因豬。同時，各種轉基因載體體系的改進，特別是轉座子等具有介導基因主動整合載體的出現(xiàn)，顯著提高轉基因在豬基因組上的整合效率。另外，ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9基因編輯技術可實現(xiàn)基因的定點修飾，為研究特定基因功能及基因定點改造等提供技術條件。盡管目前還存在基因脫靶等問題，但未來轉基因技術的發(fā)展目標必將是以實用性和安全性為立足點，建立起高效、安全、簡便的轉基因豬技術，基因定點編輯技術必將成為轉基因技術的核心。此外，轉基因豬的生物安全性問題是人們關注的重點，在加強對轉基因豬技術的完善和安全評估管理的同時，引導人們對轉基因生物的正確認識，才能使轉基因技術得以健康發(fā)展。

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(編輯程金華)

Transgenic Pig Technology and Its Application in Agriculture

ZENG Fang，LI Zi-cong，DONG Rui，WU Zhen-fang，WANG Chong*

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAgro-animalGenomicsandMolecularBreeding，NationalEngineeringResearchCenterforBreedingSwineIndustry，CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Key words:pig；transgenesis；microinjection；gene targeting

Abstract:Transgenic pig technology can be used in pig breeding as well as biological medicine.It has valuable application in improving the production level of pig industry and the health of human.Here recent research progresses of transgenic pig technology were summarized by focusing on the micromanipulation technique and the gene integration method which were the keys for transgenic pig production.The current applications of transgenic pig technology in agriculture also were summarized.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.002

收稿日期：2015-06-30

基金項目：廣東省自然科學基金博士科研啟動項目(2014A030310500); 廣東省家畜分子與細胞工程育種技術研究團隊項目(2011A020102003)

作者簡介：曾芳(1982-)，女，湖南醴陵人，博士后，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：zengf8210@163.com *通信作者：王翀，教授，博士生導師，E-mail：betty@scau.edu.cn

中圖分類號：S814.8；Q812

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0218-07