杜鳳林，張秀玲

（1.吉林省鎮(zhèn)賚縣畜牧業(yè)管理局，吉林 鎮(zhèn)賚 137303；2.鎮(zhèn)賚縣東屏鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林 鎮(zhèn)賚 137303）

牛結(jié)核病疫苗研究進(jìn)展

杜鳳林1，張秀玲2

（1.吉林省鎮(zhèn)賚縣畜牧業(yè)管理局，吉林 鎮(zhèn)賚 137303；2.鎮(zhèn)賚縣東屏鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林 鎮(zhèn)賚 137303）

牛結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅到人類的經(jīng)濟(jì)安全和食品健康安全的主要人獸共患病傳染病，其病原菌牛結(jié)核分支桿菌宿主范圍廣，易感動(dòng)物為牛，其次是人、禽類和野生動(dòng)物等。牛結(jié)核病病灶的位置與其感染途徑有關(guān)，當(dāng)牛結(jié)核分枝桿菌通過氣溶膠的形式，經(jīng)過被感染動(dòng)物的呼吸道系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)，依次感染動(dòng)物的鼻粘膜、口腔黏膜、肺以及與呼吸系統(tǒng)相關(guān)的組織器官。然而當(dāng)牛結(jié)核分枝桿菌通過飼草或者飲水感染牛時(shí)，結(jié)核病灶一般會(huì)出現(xiàn)在牛的腸系淋巴結(jié)中。牛結(jié)核病病理變化是在病變組織上出現(xiàn)粟粒性結(jié)核結(jié)節(jié)，呈現(xiàn)灰色或米白色顆粒狀干酪樣壞死組織且相互之間沒有明顯的界限。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，預(yù)防牛結(jié)核病疫苗的種類日新月異，本文將對(duì)牛結(jié)核病疫苗做一個(gè)整體概述。

1　卡介苗（BCG）

卡介苗是目前唯一一個(gè)被廣泛認(rèn)可的傳統(tǒng)的預(yù)防結(jié)核病疫苗，它來源于減毒的結(jié)核分枝桿菌，最初通過在甘油-土豆培養(yǎng)基反復(fù)連續(xù)傳代200多次，最終使其在免疫原性存在的基礎(chǔ)上使其毒力減弱，致病性消失。該疫苗目前為止是預(yù)防牛結(jié)核病最權(quán)威的疫苗，為世界上牛結(jié)核病及人結(jié)核病的預(yù)防做出了巨大的貢獻(xiàn)。但是該疫苗也存在一定的局限性，具體表現(xiàn)為年齡依賴性，即對(duì)新生牛的免疫效率能夠達(dá)到80%以上，而對(duì)成年牛或動(dòng)物的免疫效率只有50%左右。同時(shí)，BCG接種的牛在對(duì)其利用牛結(jié)核菌素（PPD）進(jìn)行皮試反應(yīng)檢測(cè)結(jié)核病時(shí)，不能夠區(qū)分出是自然感染牛還是BCG接種牛，從而嚴(yán)重干擾牛結(jié)核病陽性結(jié)果的判定，為牛結(jié)核病的檢測(cè)造成困難。因此，迫切需要更加安全有效的新型預(yù)防牛結(jié)核病疫苗的研發(fā)及應(yīng)用。

2　重組卡介苗

rBCG30是第一代重組卡介苗，是將pMBT30質(zhì)粒重組到了卡介苗當(dāng)中，從而過表達(dá)30-kDA Ag85B蛋白，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中 rBCG30表現(xiàn)出比BCG更好的保護(hù)作用，能夠引起更高水平的免疫應(yīng)答。在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中用結(jié)核菌素作為對(duì)照組，rBCG30同樣也表現(xiàn)出良好的免疫原性。在安全性方面的實(shí)驗(yàn)中，rBCG30與BCG的試驗(yàn)結(jié)果大致相同。第二代重組BCG疫苗是VPM1002，這種疫苗是基于對(duì)結(jié)核桿菌的兩次基因修復(fù)。將編碼李斯特菌溶胞素（Hly）的基因整合到BCG基因組中，Hly可以在巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后形成的吞噬體內(nèi)形成空隙以便結(jié)核菌素進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。與BCG相比，VPM1002可以進(jìn)入到吞噬體內(nèi)進(jìn)而可以參與到主要組織相容性復(fù)合體（MHCⅡ）通路中。然而該重組BCG疫苗也有一定的缺陷，雖然利用基因工程技術(shù)使該重組BCG疫苗大量表達(dá)Ag85A、Ag85B和Rv3407三種蛋白并產(chǎn)生產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素，與Hly類似可以穿透巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜讓BCG可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，而且也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中由于其安全性的原因并沒有被應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。

3　減毒結(jié)核分枝桿菌疫苗

減毒結(jié)核分枝桿菌菌株又被稱為是減毒活疫苗，在保留牛結(jié)核分枝桿菌免疫活性的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)將牛結(jié)核分枝桿菌基因組中的致病基因進(jìn)行敲除或者突變，從而使牛結(jié)核分枝桿菌侵染宿主細(xì)胞所必須的蛋白質(zhì)得不到表達(dá)，也就降低了其感染活性，削弱了其致病性。BCG本質(zhì)上就是一種減毒活疫苗，但是由于BCG長(zhǎng)時(shí)間的傳代導(dǎo)致其基因組中的一些與免疫活性有關(guān)的基因丟失，從而降低了其免疫原性。人結(jié)核病的減毒活疫苗MTBVAC01已經(jīng)到了Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段，也是唯一一個(gè)應(yīng)用于Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)的一株減毒結(jié)核分枝桿菌活疫苗。

在牛結(jié)核分枝桿菌活疫苗的研究中，現(xiàn)階段最理想的方案是在找到并敲除牛結(jié)核分枝桿菌基因組中的兩個(gè)與菌株毒力有關(guān)的區(qū)域，從而可以避免弱毒菌株在動(dòng)物體內(nèi)的毒力得以恢復(fù)。有研究通過化學(xué)突變的方法已經(jīng)得到了兩個(gè)牛結(jié)核分枝桿菌弱菌株而且在豚鼠和牛的試驗(yàn)中表現(xiàn)出低毒性的效果。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的牛結(jié)核分枝桿菌由于突變導(dǎo)致其自身不能合成參與其自身代謝的必需氨基酸，從而存活時(shí)間較短，對(duì)機(jī)體的毒力明顯減弱，因此可以作為牛結(jié)核病弱毒疫苗。但是上述弱毒菌株的免疫原性與BCG效果相當(dāng)，對(duì)免疫動(dòng)物的保護(hù)作用并不是非常突出，因此還需要研究免疫效果表現(xiàn)良好且無毒力的弱毒牛結(jié)核分枝桿菌疫苗。

4　亞單位疫苗

牛結(jié)核病亞單位疫苗主要是利用原核或真核表達(dá)載體，使對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌具有免疫原性的蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)劑的作用下能夠在體外或體內(nèi)大量表達(dá)。在牛結(jié)核分支桿菌分泌的ESAT-6蛋白基礎(chǔ)上研發(fā)的亞單位疫苗能夠增強(qiáng)試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌免疫原性。除此之外，能夠作為亞單位疫苗的候選分泌蛋白主要有Ag85A、Ag85B、MPT-64、MPT-32、HSP-76、HSP-70等，這些蛋白一直是被作為預(yù)防牛結(jié)核病亞單位疫苗研究的重點(diǎn)，其中Ag85B和ESAT-6亞單位疫苗已經(jīng)進(jìn)入到Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段。亞單位疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是針對(duì)性強(qiáng)，沒有其他雜蛋白的干擾，對(duì)機(jī)體的副作用小。在表達(dá)目的蛋白的基因上加上組氨酸標(biāo)簽有利用目的蛋白的純化和大規(guī)模制備，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。與卡介苗最大的區(qū)別是，亞單位疫苗并不會(huì)干擾PPD的皮試結(jié)果，且不會(huì)出現(xiàn)毒力恢復(fù)的現(xiàn)象進(jìn)而能夠保障機(jī)體的安全性。此類疫苗的不足之處是其免疫效果并不如BCG和牛結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗理想，對(duì)免疫動(dòng)物需要進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫從而增加了免疫程序和成本。由于亞單位疫苗在動(dòng)物體內(nèi)主要引起的免疫反應(yīng)屬于體液免疫，而牛結(jié)核分枝桿菌卻是典型的細(xì)胞內(nèi)寄生，因此這類疫苗并不是預(yù)防牛結(jié)核病最為理想的候選疫苗。

5　DNA疫苗

DNA疫苗指的是利用含有表達(dá)具有牛結(jié)核病免疫原性的蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒，來免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。與亞單位疫苗相比該疫苗的制備過程相對(duì)比較簡(jiǎn)單快捷，且在免疫動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，能夠?yàn)槊庖邉?dòng)物提供長(zhǎng)時(shí)間的免疫保護(hù)作用。用做該疫苗免疫原的蛋白質(zhì)主要有ESAT-6、CFP-10（Culture filtrate protein-10）、MPT64、MPT83、熱休克蛋白Hsp-65等。核酸疫苗最大的缺點(diǎn)是單獨(dú)使用對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)效果不佳，與完全佐劑或者免疫刺激因子CD86、CD80混合使用可以提高對(duì)機(jī)體的免疫作用。在細(xì)胞免疫水平上，其免疫效果略微強(qiáng)于亞單位疫苗的作用，但是與BCG疫苗相比還是有待提高。

6　重組活病毒載體疫苗

此類疫苗是將常見的病毒利用基因工程手段將其基因組中的毒力基因進(jìn)行敲除或者敲除負(fù)責(zé)病毒DNA復(fù)制的基因，在保證安全的基礎(chǔ)上得到能夠插入大量外源基因的復(fù)制缺陷型病毒表達(dá)載體。常見的病毒載體主要有經(jīng)過基因工程改造的痘病毒、禽痘病毒、腺相關(guān)病毒和腺病毒等。有研究用BCG對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物初免，再用含有Ag85A的重組腺相關(guān)病毒對(duì)其進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取得了比較好的免疫效果。MVA85A是安卡拉牛痘病毒經(jīng)過改良后能夠表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Ag85A免疫蛋白的重組病毒，也可以用來對(duì)BCG免疫刺激以后的動(dòng)物或者人類進(jìn)行加強(qiáng)免疫。一些臨床試驗(yàn)表明MVA85A作為疫苗對(duì)免疫個(gè)體足夠安全且免疫時(shí)間持續(xù)較長(zhǎng)。但是對(duì)該疫苗的免疫效果卻一直存在著很大的爭(zhēng)論，有人將BCG和MVA85A重組病毒疫苗混合免疫動(dòng)物比BCG免疫動(dòng)物所得到的免疫效果要明顯很多。然而在非洲地區(qū)卻不能得到同樣的免疫效果，這可能意味著這類疫苗對(duì)生活在熱帶氣候地區(qū)的人或動(dòng)物比生活在溫帶氣候的人或動(dòng)物的免疫活性要低，這可能跟結(jié)核分枝桿菌的抗原暴露在較高的溫度下情況有關(guān)。

7　結(jié)語

近年來隨著對(duì)預(yù)防牛結(jié)核病疫苗研究的愈發(fā)深入，各類疫苗均有自身的不同的優(yōu)缺點(diǎn)。但截至目前，從疫苗的免疫效果和對(duì)免疫動(dòng)物的保護(hù)作用及疫苗的安全性而言，仍然沒有任何一種疫苗能超越BCG。而現(xiàn)在很多新型結(jié)核病疫苗的研究也都是以BCG為基礎(chǔ)，考慮的范疇也都是從降低BCG疫苗的副作用防治毒力返回、提高BCG疫苗的免疫原性并使其對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫增強(qiáng)、與重組病毒疫苗采取異源初免-加強(qiáng)免疫的方式增強(qiáng)免疫和以BCG為基礎(chǔ)研究的二連基因工程重組疫苗等，此類新型疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也都獲得了較好的免疫效果，但是其安全性和有效性也在進(jìn)一步的研究中。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展以及研究人員對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理的進(jìn)一步了解，可以進(jìn)一步的為牛結(jié)核病新型有效疫苗的的研究提供更多的理論依據(jù)，相信不久的將來從事牛結(jié)核病疫苗研究的科研工作者能夠研究出更加高效、安全、實(shí)用的牛結(jié)核病疫苗。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.003