房莉莉

（黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心，黑龍江哈爾濱150069）

病料中細(xì)菌分離培養(yǎng)方法和抗生素敏感性試驗(yàn)

房莉莉

（黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心，黑龍江哈爾濱150069）

1　細(xì)菌分離培養(yǎng)的常用方法

細(xì)菌分離培養(yǎng)的常用方法有平板劃線分離法、加熱分離法和實(shí)驗(yàn)動物分離法。

1.1平板劃線分離法這是目前臨床上最常用的分離接種方法。它可以從被檢病料中通過劃線分離而獲得單個菌落，以便挑選可疑菌落作純培養(yǎng)加以鑒定。具體操作：右手持接種棒，在酒精燈上火焰滅菌；待接種環(huán)冷卻后，挑取被檢料少許，左手持瓊脂平板，以食指為支點(diǎn)，用拇指和無名指將平皿揭開一空隙。大約20℃時，迅速地將接種環(huán)輕輕地涂布在培養(yǎng)基的邊緣。然后，在涂布處來回移動作曲線形劃線接種。劃線時，以腕力使接種環(huán)在瓊脂平板表面劃動，盡量不要劃破培養(yǎng)基，劃的線條要密，但不能重復(fù)舊線，以免培養(yǎng)物形成菌苔。劃線完畢，合上平皿蓋，將瓊脂平板倒置，放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2加熱分離法此法適用于污染病料中芽孢桿菌或梭菌的分離。先將被檢病料接種于一管液體培養(yǎng)基，然后將其置于水浴鍋中，加熱到80℃，維持20min，殺死病料中非芽孢菌，而帶有芽孢的細(xì)菌仍可存活。再用接種環(huán)取此液于瓊脂平板上劃線分離，視被檢菌的性質(zhì)做需氧或厭氧培養(yǎng)。如估計(jì)液體內(nèi)帶有芽孢的細(xì)菌數(shù)量少，可先將接種被檢病料的液體培養(yǎng)基作增菌培養(yǎng)后，再在平板上劃線分離。

1.3實(shí)驗(yàn)動物分離法此法適用于污染嚴(yán)重的病理材料。如果用常規(guī)的方法，則難以分離到病原菌。具體方法：將被檢病料用生理鹽水或營養(yǎng)肉湯作1：5～10倍稀釋，置于離心機(jī)內(nèi)，按1000轉(zhuǎn)/min的速度離心。取其上清液接種易感實(shí)驗(yàn)動物，而污染的細(xì)菌則被機(jī)體消滅。待動物死亡后，可立即從其心血或病變組織中分離病原菌。

2　細(xì)菌對抗生素敏感性試驗(yàn)

測定細(xì)菌對抗生素敏感性試驗(yàn)，簡稱藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)對于家禽和特禽細(xì)菌性疾病的有效治療起著關(guān)鍵性的作用。由于各種病原菌對抗菌藥物的敏感性不同，即使是同種細(xì)菌的不同菌株對同一種藥物的敏感性亦有差異。尤其近年來，在獸醫(yī)臨床上廣泛使用抗生素，導(dǎo)致耐藥性菌株不斷出現(xiàn)。如果在臨床上盲目地使用抗生素，往往不能達(dá)到預(yù)期的效果。因此，在臨床治療前，有條件的飼養(yǎng)場應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以篩選有效的抗菌藥物。

細(xì)菌對抗生素的敏感性分為高敏、中敏、低敏和耐藥4種。高敏和中敏是臨床上首選的抗菌藥物，而低敏和耐藥者一般不能應(yīng)用。測定藥物敏感試驗(yàn)的方法有多種，但臨床上普遍應(yīng)用的是紙片擴(kuò)散法。

2.1藥敏紙片的準(zhǔn)備可以使用事先制備的干燥藥敏紙片或市售常用的藥敏紙片，亦可將滅菌的干燥紙片在臨用前浸泡抗菌藥液。

2.2瓊脂培養(yǎng)基的選擇 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)選擇適合該菌生長的培養(yǎng)基。其配制方法為：取牛肉300g，去脂肪、腱后絞碎，加蒸餾水1000mL，煮沸1h制成肉浸湯。過濾后，補(bǔ)足水量，再加入酪蛋白酸性水解物17.5g、可溶性淀粉1.5g、瓊脂17g，加溫溶解。調(diào)整pH至7.4，于121℃高壓蒸汽滅菌15min，在90mm直徑的平皿上傾注成4mm厚的瓊脂平板。此外，臨床上也常用普通營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，如巴氏桿菌、鏈球菌等，應(yīng)選用血平板培養(yǎng)基。

2.3菌液的準(zhǔn)備用接種環(huán)挑取被檢菌純培養(yǎng)菌落4～5個，接種在4～5mL的肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)5～10h。用生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，使其濃度相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)濁度管（抑菌圈的大小受菌液濃度的影響較大，因而菌液培養(yǎng)的時間不宜超過17h）。

2.4藥敏試驗(yàn)操作方法菌液的接種有劃線法和涂布法，即用接種環(huán)蘸取菌液，均勻地劃線或涂抹在瓊脂平板上。待平皿面稍干后，用鑷子夾取各種藥敏紙片，平放在平板上，并輕壓使其貼在平板表面，藥敏紙片7張。兩紙片中心距離不少于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm。貼好紙片的瓊脂平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。

2.5結(jié)果判定根據(jù)藥敏紙片周圍的抑菌圈大小，測定該菌的抗藥程度。因此，必須測量抑菌直徑，按其直徑報(bào)告該菌株對某種藥物是高敏、中敏、低敏或耐藥。一般直徑大于 15mm為高敏，10～15mm為中敏，小于10mm為低敏。

2.6影響藥敏試驗(yàn)的因素藥敏紙片抑菌圈的大小，往往也受一些因素的作用而影響結(jié)果的判定。如菌液的濃度、培養(yǎng)基的厚度，都對抑菌圈的大小產(chǎn)生直接的影響。菌液濃度過大、培養(yǎng)基越厚，紙片周圍藥物濃度就越低、抑菌圈也就越小。因此，菌液的濃度應(yīng)相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)濁度管，培養(yǎng)基厚度也不能超過4mm。其次，培養(yǎng)基中的pH對某些藥物抑菌區(qū)影響很大。例如，偏酸時四環(huán)素的抑菌圈變大、紅霉素的抑菌圈變小，故培養(yǎng)基的pH應(yīng)為7.2～7.4。此外，瓊脂的濃度亦對抑菌圈有影響。瓊脂濃度越大，抑菌圈越小。一般瓊脂的濃度應(yīng)為1.5%。除上述因素外，平板蓋內(nèi)的水滴落在瓊脂平板上也會影響藥敏試驗(yàn)的判定結(jié)果。因此，放在冰箱中保存的瓊脂平板取出后應(yīng)放置在37℃溫箱中10min，以除去附在平板蓋內(nèi)的水滴，避免各種不良因素影響藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.015