孟靖順 吳建華 趙靜 王玉蓮 薛偉

(1.上海長海醫(yī)院，上海 200433；2.中國科學院大學，上海 200031)

·論著·

白念珠菌HSP90與人源HSP90的克隆表達及其C端的比較分析

孟靖順1吳建華1趙靜1王玉蓮1薛偉2

(1.上海長海醫(yī)院，上海 200433；2.中國科學院大學，上海 200031)

目的 分別體外表達純化白念珠菌HSP90 (CaHSP90)和人源HSP90 (hHSP90)并分析C-端序列差異對其體外狀態(tài)下分子聚合度的影響。方法 我們將CaHSP90、hHSP90野生型及其C-端酶切堿基序列通過PCR進行擴增并通過NdeI/XhoI酶切位點連接到到pET22b+質(zhì)粒中。將構(gòu)建好的上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)中進行表達并通過Ni2+-NTA柱以及Superdex-200快速柱層析系統(tǒng) (FPLC)純化。所得蛋白通過SDS-PAGE以及分子排阻色譜 (SEC)測定分子量和聚合狀態(tài)。結(jié)果 通過測序鑒定所有質(zhì)粒構(gòu)建成功，并最終純化得到足夠純度的蛋白進行SEC分析實驗。分析結(jié)果表明野生型CaHSP90和hHSP90在體外具有相似的聚合度，而C-端突變后則存在明顯差異。結(jié)論 CaHSP90和hHSP90的C-端結(jié)構(gòu)域?qū)ζ潴w外聚合狀態(tài)有著不同的影響，CaHSP90的C-端結(jié)構(gòu)域有可能成為CaHSP90抑制劑一個潛在靶點。

白念珠菌；HSP90；蛋白結(jié)構(gòu)；蛋白表達與純化

[Chin J Mycol，2016，11(6):321-326]

白念珠菌是一種條件致病菌，近年來隨著抗菌藥物的濫用，白念珠菌的致病率逐年上升。由于白念珠菌對藥物的耐受性越來越強，我們對于白念珠菌的抗藥性研究也不斷深入。研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌的HSP90在白念珠菌的致病以及耐藥機制中有重要作用[1]。

HSP90參與了白念珠菌的生長和耐藥等多條通路[2]，HSP90參與的白念珠菌耐藥的主要通路包括了MCK1通路和蛋白磷酸酶 (Calcineurin)通路[3]。研究發(fā)現(xiàn)HSP90的敲除會使白念珠菌的耐藥性大大降低[4]，HSP90在白念珠菌體內(nèi)主要通過折疊轉(zhuǎn)運部分重要的耐藥因子起作用[5]。白念珠菌體內(nèi)存在了大量HSP90的客戶蛋白[6]，它們包括耐藥蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，在高鹽、高溫、pH、藥物作用等不同的環(huán)境和條件下，HSP90在白念珠菌體內(nèi)會參與不同的耐藥機制與不同的客戶蛋白相結(jié)合[7]。

如何阻斷和影響HSP90與白念珠菌耐藥因子的結(jié)合是降低白念珠菌耐藥性的一種新途徑。研究發(fā)現(xiàn)HSP90C端在HSP90的輔助功能中起到重要作用，C端的結(jié)構(gòu)變化會直接影響HSP90的二聚體形成從而抑制HSP90與客戶蛋白的結(jié)合[8]。我們通過質(zhì)粒構(gòu)建，蛋白的表達，鎳柱純化，Superdex蛋白分析等技術(shù)手段對白念珠菌HSP90在體外進行了研究，發(fā)現(xiàn)在體外，白念珠菌HSP90C端部分缺失后白念珠菌HSP90的二聚結(jié)構(gòu)明顯改變，而人體HSP90的二聚結(jié)構(gòu)沒有明顯的變化，人體HSP90C端部分切除后接近于二聚形態(tài)的存在。中科院已有研究證明HSP90在體外多聚形態(tài)的發(fā)生與其蛋白性質(zhì)有關(guān)，跟它本身二聚結(jié)構(gòu)變化沒有明顯關(guān)系[9]，多聚體的形成主要是C端的改變以及溫度等變化引起，這為進一步了解了白念珠菌HSP90的結(jié)構(gòu)并為以后開展白念珠菌HSP90的體外研究提供了技術(shù)支持。

1 材 料

1.1 菌株和質(zhì)粒

本次研究所使用的BL21大腸桿菌菌株主要購自上海士鋒有限公司，TOP10感受態(tài)細胞由上海中科院生命科學院提供。SC5314菌株基因庫由中科院生命科學院真菌實驗組提供。pET22b質(zhì)粒和人體HSP90cDNA由上海中科院生命科學院提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物 (YEAST EXTRACT，英國Oxoid公司)+1%蛋白胨 (TRYPTONE，同上)+1%NaCl (國藥集團化學試劑有限公司)，121℃高壓滅菌；含氨芐青霉素 (Ampicillin，上海生工生物有限公司)的LB固體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物 (YEAST EXTRACT，英國Oxoid公司)+1%蛋白胨 (TRYPTONE，同上)+1%NaCl (同上)+1.5%瓊脂粉 (國藥集團化學試劑有限公司)，121℃高壓滅菌，倒板。

1.3 主要試劑盒儀器

Taq酶 (購自Takara公司)；KOD酶 (購自TOYOBO公司)；DNAmark (天根)；限制性內(nèi)切酶NDEΙ、XhoΙ (購自Fernenters公司)；連接酶ligase酶 (購自TOYOBO)；膠回收試劑盒 (購自Waston公司)；Ni-NTAagarose (購自德國Qiagen公司)；PCR儀 (Verite公司，美國)；紫外分光光度計島津UV-2100 (購自島津公司)；紫外線掃描儀 (Alpha Innotech公司)；蛋白膠掃描儀 (GE公司)；蛋白水平電泳儀 (BIO-RAP公司)；高速冷凍離心機ThermoR6+ (Thermo Fish公司)；凝膠過濾層析柱superdex200和儀器AKTK-FPLC (購自GE公司)。

1.4 引物

CaHSP90，hHSP90的堿基序列全長分別為2 121 bp和2 172 bp。我們用multalin軟件處理后選擇了相應(yīng)的酶切位點主要包括Nde1和Xho1。我們根據(jù)pET22b質(zhì)粒酶切位點，設(shè)計了CaHSP90，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)，hHSP90，hHSP90 (1-696)，hHSP90 (1-679)等質(zhì)粒，并根據(jù)primer軟件設(shè)計了相關(guān)的引物。引物合成主要有上海生工生物有限公司合成。

2 方 法

2.1 實驗設(shè)計

通過計算機軟件multalin對白念珠菌HSP90和人體HSP90的對比分析發(fā)現(xiàn)人體HSP90和白念珠菌HSP90的同源性接近65%，尤其是N端和M區(qū)域蛋白氨基酸序列同源性較高，只有二者的C端和最短的linker區(qū)域差異性最大。通過對相關(guān)文獻的以及軟件分析得出白念珠菌HSP90C端氨基酸序列655-707對應(yīng)于人體的HSP90的679-723，這段C端氨基酸序列在HSP90的結(jié)構(gòu)以及功能中起到關(guān)鍵的作用，所以我們構(gòu)建了人源HSP90與白念珠菌HSP90的C端缺失質(zhì)粒 (見表1)，然后用體外研究的方式來發(fā)現(xiàn)兩者的差異。

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

設(shè)計引物 (見表2)后用KOD體系進行PCR以白念珠菌HSP90和人體HSP90以及相關(guān)目的基因為模板片段擴增。KOD體系：1 μL KODpuls，0.5 μL Template，1.5 μL Primer F，1.5 μL Primer R，5 μL 10×KOD buffer，5 μL dNTP，2μL MgSO4，33.5 μL ddH2O，總體系50 μL。PCR反應(yīng)體系：95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)，72℃ 10 min進行充分延伸。PCR完成后PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳40 min 110 V，用DNA試劑盒膠回收。酶切，將膠回收產(chǎn)物進行酶切，酶切體系為：20 μL回收產(chǎn)物，3 μL 10×bufferH，1 μL Nde1，1 μL Xho1，5 μL ddH2O，總體系30 μL，酶切反應(yīng)條件：水浴3 h，37℃；連接，在酶切結(jié)束后用質(zhì)粒抽提試劑盒對酶切產(chǎn)物進行洗滌，12 μL 2×ligase，10 μL質(zhì)粒pET22b，12 μL酶切產(chǎn)物，連接條件：室溫，2 h；轉(zhuǎn)化，將17 μL連接產(chǎn)物加入70 μL TOP10感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化條件：冰浴30 min ，42℃熱激90 s，涂LB培養(yǎng)板，37℃過夜；挑單克隆，在事先準備好的5 mL LB小管中加入5 μL氨芐青霉素，用槍頭將平板上的菌落挑入5 mL培養(yǎng)基小管，條件：37℃，200 r/min，6 h。菌液PCR進行鑒定，反應(yīng)體系：2×Taq酶12.5 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體系25 μL，取200 μL菌液到上海生工生物有限公司測序，將有目的條帶的剩余菌液用質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒抽提。

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 實驗涉及的引物序列

2.3 蛋白的表達與純化

將測序完的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞，1 μL目的質(zhì)粒加入70 μL BL21感受態(tài)細胞中冰浴30 min，42℃熱激90 s，涂板，37℃過夜，挑單克隆抗體，將菌落挑至5 mL含氨芐青霉素培養(yǎng)基中，200 r/min，8 h后接入1 L含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，200 r/min，3 h加1 mL IPTG誘導(dǎo)劑，168 r/min，23℃，11 h。6 000 r/min，6 min離心收菌，用40 mL Thrombin buffer稀釋沉淀，破菌15 min，Thrombin buffer 1 L配制：25 mmol/L Tris 6.06 g，150 mmol/L NaCl 8.77 g，pH 8.0，破菌后用15 000 r/min高速離心15 min，取上清，上6×His 5 mL鎳柱，因為pET22b質(zhì)粒C端帶有his-tag標簽，所以利用重力原理的方法目的蛋白會與鎳柱填料特異性結(jié)合。純化流程：用20 mLThrombin buffer平衡鎳柱，流速為2 mL/min，取20 mL上清上樣，流速為0.6 mL/min；取20 mL Thrombin buffer上柱將雜蛋白快速洗脫；用20 mL Ni-NTA elution buffer上柱，將目的蛋白洗脫，流速為0.6 mL/min。Ni-NTA elution buffer 1 L配制：50 mmol/L Na2HPO4·2H2O 7.8 g，500 mmol/L NaCl 29.22 g，250 mol/L Imidazole 17.02 g，pH 8.0。分別取誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后，破碎后上清，Thrombin buffer洗脫液，Ni-NTA elution buffer洗脫液40 μL加入40 μL 2×蛋白上樣緩沖液，100℃煮樣，5 min，配制12%蛋白膠體，上樣進行蛋白電泳200 V，50 min，考馬斯亮染色。

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

將純化后蛋白用10 kD超濾離心管濃縮，5 400 r/min，15 min。將濃縮后蛋白樣品進行離心，取3 mL樣品進行上樣，用制備柱Superdex200進行NMRbuffer置換以及近一步純化。1 L NMR配制：13.7 mmol/L NaH2PO4·12H2O 2.14 g，6.3 mmol/L 3Na2HPO4·2H2O 2.26 g，50 mmol/L NaCl 2.92 g，pH 8.0。AKTK-FPLC接上buffer后，進行柱體積平衡，流速設(shè)為0.6 mL/min，柱體積為130 mL。將收集后的蛋白進行再次濃縮并用紫外線分光光度計進行濃度測定，將分光光度計波長調(diào)至280 nm，測定體積為100 μL。將濃度統(tǒng)一稀釋到50 μmol/L，上樣前用標準物質(zhì)過柱測出分析柱標準計算公式，再用NMRbuffer平衡分析柱，樣品離心后上Superdex200分析柱蛋白分析，分析柱流速設(shè)為0.3，體積為30 mL。過柱時將收到的主峰蛋白進行SDS-PAGE，再用考馬斯亮藍染色。

3 結(jié) 果

3.1 CaHSP90，hHSP90以及相關(guān)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

CaHSP90以及C端部分切除的質(zhì)粒通過PCR進行擴增PCR結(jié)果見圖1。菌液PCR鑒定CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)，我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白都進行了正常的質(zhì)粒復(fù)制 (見圖2)。人體的HSP90瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 (見圖3)，通過上海生工生物有限公司質(zhì)粒測序發(fā)現(xiàn)HSP90沒有位點發(fā)生突變，包括C端部分切除的HSP90。

3.2 CaHSP90，hHSP90以及它們C端部分切除后的蛋白電泳結(jié)果

在構(gòu)建了CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)、hHSP90、hHSP90 (1-679)、hHSP90 (1-696)等質(zhì)粒后，通過復(fù)制轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞進行表達純化。我們發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90以及C部分切除后白念珠菌HSP90在大腸桿菌中能夠大量表達和純化，在pET22b質(zhì)粒C端具有6×his-tag標簽通過與his-鎳柱特異性結(jié)合得到目的蛋白再進行SDS-PAGE，見圖4，HSP90分子質(zhì)量為82 kD。圖5為人體HSP90以及C端部分切除后的蛋白純化結(jié)果，hHSP90為88 kD。

3.3 用凝膠過濾層析柱進行蛋白分析

將白念珠菌HSP90以及白念珠菌HSP90C端部分切除后的蛋白進行濃縮，然后用凝膠過濾層析柱superdex200進行蛋白質(zhì)分析，我們采用同樣的方法對人體的HSP90以及人體HSP90C端部分切除的蛋白進行分析，最后進行比較。本次實驗主要測試濃度為50 μmol，上樣量統(tǒng)一為100 μL，過superdex200進行分析，結(jié)果見圖6，將出峰體積代入標準公式計算分子質(zhì)量，我們發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90 (1-655)分子質(zhì)量為114.3 kD，單體為77 kD，介于單體和二體之間，而相對應(yīng)的人體HSP90 (1-679)為176.5 kD,單體為78 kD，所以為二體。本文中CaHSP90全長、hHSP90全長和CaHSP90 (1-673)三個都形成了多聚體。通過該實驗我們發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90在C端655至末端部分切除后會影響其二聚狀態(tài)，使其由二聚向單體過渡，這從理論上破壞了白念珠菌HSP90的二聚體結(jié)構(gòu)，二聚體結(jié)構(gòu)的破壞將影響HSP90的輔助功能。關(guān)于人源HSP90，我們主要設(shè)計了3個實驗，見圖7～9。圖7～9中3條線分別代表3個蛋白濃度梯度，本次實驗我們主要是研究50 μmol這條梯度的蛋白樣品，結(jié)構(gòu)顯示：hHSP90的出峰體積10.47 mL,分子質(zhì)量268 kD，為多聚體 (見圖7)；hHSP90 (1-679)的出峰體積11.53 mL,分子質(zhì)量176.5 kD，為二聚體 (見圖8)；hHSP90 (1-696)，出峰體積8.62 mL，分子質(zhì)量588 kD，為多聚體 (見圖9)。我們推斷人hHSP90c和CaHSP90C端部分序列對于HSP90二聚體的形成有較大差異。為了證明白念珠菌HSP90未出現(xiàn)明顯降解，我們將過superdex200分析的蛋白樣品重新收集，進行蛋白電泳，見圖10。

4 討 論

目前而言有關(guān)白念珠菌的分子生物學發(fā)展較快，但部分領(lǐng)域仍然不足。本次實驗中我們通過計算機軟件分析了人源HSP90與白念珠菌HSP90的蛋白氨基酸序列的差異 (見圖11)。

在后續(xù)的體外實驗中，首先我們通過pET22b質(zhì)粒構(gòu)建了CaHSP90、CaHSP90 (1-673)和CaHSP90 (1-655)，并通過PCR和菌液PCR成功擴增鑒定了目的序列。這套方法對于構(gòu)建白念珠菌相關(guān)基因載體以及部分基因缺失的載體有指導(dǎo)作用，對以后研究白念珠菌的部分基因序列提供了一定的技術(shù)支持。

其次我們運用了His-鎳柱的蛋白純化技術(shù)對白念珠菌HSP90以及部分C端切除后的HSP90蛋白進行純化，我們發(fā)現(xiàn)CaHSP90、CaHSP90 (1-673)、CaHSP90 (1-655)能夠在體外表達純化并能夠得到特異性較高的目的蛋白，這為以后進行白念珠菌關(guān)鍵蛋白體外實驗功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 白念珠菌HSP90 PCR電泳圖全長，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)電泳圖，全長分別為2 121 bp、2 019 bp、1 965 bp 圖2 CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655)，CaHSP90在Top10感受態(tài)細胞中克隆表達后電泳圖 圖3 hHSP90 (1-679)，hHSP90 (1-696)和hHSP90的電泳結(jié)果圖 圖4 白念珠菌HSP90，白念珠菌HSP90 (1-673)，白念珠菌HSP90 (1-655)的蛋白his-鎳柱純化后蛋白電泳圖 圖5 人體HSP90、人體HSP90 (1-696)、人體HSP90 (1-679)的his-鎳柱純化后蛋白電泳圖 圖6 黑線條：白念珠菌HSP90，出峰體積10.57 mL，分子質(zhì)量247.3 kD；紅色線條：CaHSP90 (1-673)，出峰體積10.76 mL，分子質(zhì)量239.4 kD；藍色線條：CaHSP90 (1-655)，出峰體積12.63 mL，分子質(zhì)量114.3 kD 圖7 人體HSP90，出峰體積10.47 mL，分子質(zhì)量268.5 kD 圖8 人體HSP90 (1-679)，出峰體積11.53 mL，分子質(zhì)量176.5 kD 圖9 人體HSP90 (1-696)，出峰體積8.62 mL，分子質(zhì)量588 kD

注：圖6～9分子質(zhì)量由標準公式Y(jié)=-0.727 7X+3.076 3，R2=0.999 8，y=logMW計算得出 (公式校準條件：Eluent 20 mmol/L PBS，50 mmol/L NaCl，pH 6.5，Sample Volume=0.5,Flow rate=0.5 mL/min，room template)

Fig.1 The electrophoresis results of CaHSP90,CaHSP90 (1-673) and CaHSP90 (1-655) Fig.2 The electrophoresis results of CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655) and CaHSP90 pET22b in the Top10 Fig.3 The electrophoresis results of hHSP90 (1-679),hHSP90 (1-696) and hHSP90 Fig.4 The purified proteins electrophoresis results of CaHSP90，CaHSP90 (1-673)，CaHSP90 (1-655) Fig.5 The His-tag purified proteins electrophoresis results of hHSP90，hHSP90 (1-673)，hHSP90 (1-655) Fig.6 Black line：CaHSP90,peak volume 10.57 mL,molecular weight 247.3 kD;Red line:CaHSP90 (1-673),peak volume 10.76 mL,molecular weight 239.4 kD;Blue line:CaHSP90 (1-655),peak volume 12.63 mL,molecular weight 114.3 kD Fig.7 hHSP90,peak volume 8.26 mL,molecular weight 268.5 kD Fig.8 hHSP90,peak volume 11.53 mL,molecular weight 176.5 kD Fig.9 hHSP90,peak volume 8.62 mL,molecular weight 588 kD The standard formula Y=-0.727 7X+3.076 3,R2=0.999 8,y=logMW (formula calibration condiion：Eluent 20 mmol/L PBS，50 mmol/L NaCl，pH 6.5，Sample Volume=0.5,Flow rate=0.5 mL/min，room template)

最后我們通過蛋白純化技術(shù)以及凝膠過濾層析柱superdex200技術(shù)進行蛋白分析，發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90C端氨基酸序列 (655-707，即655至末端)與人體HSP90C端氨基酸序列對應(yīng)部分 (679-723,即679至末端)具有較大的差異，白念珠菌HSP90 (1-655)是介于單體和二體之間，證實了氨基酸序列 (655-707)的切除對于白念珠菌HSP90的二聚結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，我們通過文獻了解HSP90輔助功能的作用機制與其二聚結(jié)構(gòu)密不可分，改變白念珠菌HSP90 的二聚形態(tài)可能會影響它與部分關(guān)鍵耐藥因子的結(jié)合，本次實驗發(fā)現(xiàn)人體HSP90氨基酸序列 (679-723)的切除對其二聚體結(jié)構(gòu)并未形成明顯改變。

圖10 白念珠菌HSP90過superdex200后的蛋白電泳圖 圖11 蛋白分析結(jié)果圖

近年來研究得出人體HSP90與白念珠菌HSP90同源性高達近65%，所以無論是HSP90N端抑制劑還是部分C端抑制劑在治療白念珠菌的同時對人體HSP90也同樣產(chǎn)生抑制作用引起較大的副作用[9]。本次研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90與人體HSP90的結(jié)構(gòu)差存在異，HSP90二聚結(jié)構(gòu)對于HSP90與客戶蛋白結(jié)合有密切聯(lián)系[10-11]，所以通過結(jié)構(gòu)差異分析對于未來研究白念珠菌HSP90特異性的抑制劑具有重要的意義。

[1] Cowen LE.The fungal Achilles' heel:targeting Hsp90 to cripple fungal pathogens[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(4):377-384.

[2] LaFayette SL,Colins C,Zaas AK,et al.PKC signaling regulates drug resistance of the fungal pathogenCandidaalbicansvia circuitry comprised of Mkc1,calcineurin,and Hsp90[J].PLoS Pathog,2010,6(8): e1001069.

[3] Leach MD,Budge S,Walker L,et al.Hsp90 orchestrates transcriptional regulation by Hsf1 and cell wall remodelling by MAPK signalling during thermal adaptation in a pathogenic yeast[J].PLoS Pathog,2012,8(12):pe1003069.

[4] Veri A,Cowen LE.Progress and prospects for targeting Hsp90 to treatfungal infections[J].Parasitology,2014,141(9):1127-1137.

[5] Singh SD,Robbins N,Zaas AK,et al.Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeastCandidaalbicansvia calcineurin[J].PLoS Pathog,2009,5(7):e1000532.

[6] Khurana N,Bhattacharyya S.Hsp90,the concertmaster:tuning transcription[J].Front Oncol,2015,5:100.

[7] Zhao R,Davey M,Kaplanek P,et al.Navigating the chaperone network:an integrative map of physical and genetic interactions mediated by the hsp90 chaperone[J].Cell,2005,120(5):715-727.

[8] Ciqlia E,Verqin J,Reimann S,et al.Resolving hot spots in the C-terminal dimerization domain that determine the stability of the molecular chaperone Hsp90[J].PLoS One,2014,9(4):e96031.

[9] Nemoto T,Sato N.Oligomeric forms of the 90-kDa heat shock protein[J].Biochem J,1998,330 ( Pt 2):989-995.

[10] Zhao H,Garg G,Zhao J,et al.Design,synthesis and biological evaluation of biphenylamide derivatives as Hsp90 C-terminal inhibitors[J].Eur J Med Chem,2015,89:442-466.

[11] Graf C,Lee CT,Eva Meier-Andrejszki L,et al.Differences in conformational dynamics within the Hsp90 chaperone family reveal mechanistic insights[J].Front Mol Biosci,2014,1.DOI:10.3389/fmolb.2014.00004.

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Purification and C-terminal domain comparison of heat shock protein 90 (HSP90) inCandidaalbicansand human

MENG Jing-shun1，WU Jian-hua1，ZHAO Jing1，WANG Yu-lian1，XUE Wei2

(1.Changhaihospital，Shanghai200433，China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Shanghai200031，China)

Objective To express and purifyCandidaalbicansHSP90 (CaHSP90) and human HSP90 (hHSP90) and to compare the different effects of C-terminal domain on their oligomeric formsinvitro.Method The encoding sequences for wild type CaHSP90,hHSP90 and their C-terminal enzyme digested base sequences were amplified via PCR and the products were cloned into pET-22b+vector using NdeI/XhoI cloning sites.The plasmids were expressed inE.coliBL21 (DE3) cells and the His-tagged proteins were purified through Ni2+-NTA column and Superdex-200 column chromatography on FPLC.The molecular weights and oligomeric forms of these proteins were analyzed by SDS-PAGE and size exclusion chromatography (SEC).Results All plasmids were successfully constructed by DNA sequencing and the proteins were pure enough for SEC analysis.The results showed that wild type CaHSP90 and hHSP90 have similar oligomeric forms,while their C-terminal mutants were different.Conclusions The C-terminal domain of CaHSP90 and hHSP90 have different effect on their oligomeric formsinvitroand might be a potential target for CaHSP90 inhibitor.

Candidaalbicans;HSP90;protein structure;protein expression and purification

973子課題 (2013CB531602)

孟靖順，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:1781069890@qq.com

吳建華,E-mail:wujh_cn@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0321-06

2016-09-28