羅小蘭綜述，毛熙光審校（四川醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

HPV16 E7蛋白在宮頸癌中的作用研究進展

羅小蘭綜述，毛熙光△審校
（四川醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

宮頸腫瘤；人乳頭瘤病毒16；基因，視網(wǎng)膜母細胞瘤；疫苗；綜述

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤的常見疾病，嚴重威脅女性的生命健康。我國每年的新發(fā)病例占世界總新發(fā)病例的30%左右，且宮頸癌患者以每年2%～3%的速度增長。近年來，多數(shù)宮頸癌調(diào)查結(jié)果顯示發(fā)病年齡趨于年輕化。現(xiàn)有研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）感染特別是高危型HPV感染是絕大多數(shù)宮頸癌癌前病變和宮頸癌的主要原因［1］。而HPV16與HPV18在宮頸癌高危型HPV中最常見。HPV16型感染多見于宮頸鱗狀細胞癌（占宮頸癌的75%～80%），而HPV18多見于宮頸腺癌（占宮頸癌的20%～25%）。E6、E7基因持續(xù)表達是宮頸上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及持續(xù)進展為宮頸癌浸潤的必要條件［2］。而HPV16的早期基因E7是致癌的關(guān)鍵基因之一，E7基因編碼的E7蛋白能與成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白結(jié)合，進一步使宿主細胞繞過R點，由DNA合成前期（G1期）直接進入DNA合成期（S期），抑制宿主細胞的凋亡，導致細胞生長失控，對腫瘤血管的新生有促進作用，與E6蛋白協(xié)同使細胞發(fā)生永生化等。但值得注意的是，E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個線性B細胞表位、CD4+T細胞表位和CD4+細胞毒性T淋巴細胞表位，與主要組織相容性復合體（MHC）分子親和力高、抗原性強，是研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。E7在宮頸癌細胞生長、增殖、遷移及細胞周期調(diào)控等方面起著重要作用，與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關(guān)。

1　HPV16　 E7　蛋白的主要生物學特性

HPV16 E7蛋白由HPV16病毒的E區(qū)基因編碼，共含有98個氨基酸的酸性磷酸蛋白，相對分子質(zhì)量為16×103～18×103。HPV16 E7蛋白有3個主要的功能區(qū)域：Ⅰ區(qū)位于第1～15位氨基酸；Ⅱ區(qū)位于第16～37位氨基酸，Ⅱ區(qū)有1個與腫瘤抑制蛋白RB相結(jié)合的位點LXCXE，位于第22～26位氨基酸。LXCXE通過與RB結(jié)合，促進其降解，使原本與之結(jié)合的真核細胞起始轉(zhuǎn)錄因子E2F失去調(diào)控而釋放，使細胞進入S期，引起細胞周期失調(diào)。Ⅱ區(qū)還含1個酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）位點，該位點上的第31、32位絲氨酸常被磷酸化，增加了HPV16 E7蛋白與轉(zhuǎn)錄因子IID（TFIID）的關(guān)鍵組件TATA合子結(jié)合蛋白的親和性，而TFIID通過與啟動子結(jié)合從而調(diào)控細胞的轉(zhuǎn)化過程。Ⅲ區(qū)位于第38～98位氨基酸，該區(qū)域內(nèi)含2個鋅指結(jié)構(gòu)和多個CTL的識別位點，可使細胞免疫應(yīng)答增強［3］?，F(xiàn)以CTL表位為基礎(chǔ)，設(shè)計以E7蛋白位靶抗原的治療性肽疫苗的研究越來越受到重視［4］。HPV16 E7蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)的LRLCV（第65～69位氨基酸）通過與核孔蛋白62（NUP 62）的FG區(qū)作用使E7能順利進入細胞核內(nèi)［5］。若E7蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生突變，E7蛋白就失去使細胞轉(zhuǎn)化的能力。

2　HPV16　 E7　蛋白在宮頸癌發(fā)生中的作用及其機制

2.1E7蛋白與pRB相互作用，使宿主細胞失去正常細胞周期調(diào)控作用細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程。細胞周期分為G1期、S期、DNA合成后期（G2期）及細胞分裂期（M期）。HPV16 E7蛋白含有2個高度保守的CR1、CR2區(qū)域及1個羧基端。羧基端內(nèi)存在2個鋅指結(jié)構(gòu)。CR2中Leu-X-Cys-X-Glu（LXCXE）結(jié)構(gòu)，能與pRB相互作用，使其發(fā)生磷酸化，釋放原本結(jié)合在pRB上的另一細胞轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F可作用于含有E2F結(jié)合位點的下游細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的基因，引起一系列調(diào)節(jié)細胞周期的細胞因子的改變，如細胞周期蛋白、p16、p107、P130及c-Myc等，使宿主細胞繞過R點，由G1期直接進入S期，抑制宿主細胞的凋亡，導致細胞生長失控［6］。另有研究表明，E7蛋白能與叉頭框蛋白M1（FoxM1）結(jié)合，并增加E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性及FoxM1的轉(zhuǎn)錄活性，從而使正常細胞周期失調(diào)［7］。

2.2HPV16 E7蛋白能夠促進腫瘤血管新生任何腫瘤的發(fā)生都必須有血管的新生過程。腫瘤的新生血管與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，因其能為腫瘤細胞提供足夠的氧氣和養(yǎng)料，且部分腫瘤細胞可通過新生的血管發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。血管生成的過程與低氧誘導因子-1α （HIF-1α）密切相關(guān)，且受到微環(huán)境中多種細胞因子的影響，如血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。在常氧環(huán)境下，HIF-1α脯氨酸發(fā)生羥基化，與von Hippel-Lindau蛋白結(jié)合，觸發(fā)泛素-蛋白酶體蛋白水解，使其半衰期迅速變短［8］。HPV16 E7蛋白可誘導組蛋白去乙?；概cHIF-1α分離，使HIF-1α依賴受體活性上調(diào)，進而促進腫瘤血管的新生［9］。HP16 E7和RB蛋白結(jié)合釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F與HPV E7基因下游的核糖核苷酸還原酶亞基M2基因結(jié)合，產(chǎn)生活性氧，激活ERK1/2信號通路，使HIF-1α和VEGF表達上調(diào)來促進血管新生，最終導致癌癥的發(fā)生［10］。免疫組織化學分析表明，RRM2水平與人類宮頸癌HPV16 E7水平呈正相關(guān)。HPV16表達E7只能使促血管生成因子表達顯著增加，但并不足以誘導內(nèi)皮細胞遷移。

2.3HVP16 E7蛋白與視黃酸受體β基因（RARB基因）的關(guān)系RARB基因是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其表達產(chǎn)物能抑制E6、E7基因的轉(zhuǎn)錄。RARB基因可通過分離轉(zhuǎn)錄因子AP-1與病毒調(diào)控區(qū)域，減弱HPV基因的表達。RARB基因甲基化可導致該基因沉默，使RARB表達缺失，對HPV16 E6、E7基因的抑制作用消失，從而E7蛋白的表達增高，促進了癌癥的發(fā)生［11］。有研究表明，轉(zhuǎn)染RARB質(zhì)粒的Hela細胞可表達視黃酸，從而抑制單克隆細胞的生長［12］。但Gutiérrez等［13］提出HPV16 E7蛋白使被HPV16感染細胞的RARB mRNA 和RARB蛋白表達增高；在表達E7蛋白的細胞中，RARB的過表達進一步導致了腫瘤抑制基因p53R237C突變的發(fā)生。RARB基因?qū)儆谀[瘤抑癌基因，理論上其在宮頸癌細胞中應(yīng)不表達或表達下調(diào)，但多項研究已證實，RARB蛋白在宮頸鱗狀細胞癌中表達增高，其具體機制目前仍不清楚。RARB作為新的抑癌基因，現(xiàn)仍有許多問題尚不清楚，其與HPV感染的關(guān)系，在宮頸鱗狀上皮細胞癌中過表達的原因尚需進一步探索。

2.5E7蛋白與感染HPV16細胞的免疫反應(yīng)及治療性疫苗HPV16 E7蛋白可與E6蛋白協(xié)同改變細胞微環(huán)境，形成有利于癌細胞發(fā)生的微環(huán)境，逃避宿主的固有免疫應(yīng)答，使宿主細胞的功能發(fā)生改變，導致宿主細胞的永生化。E6、E7蛋白還可作用于細胞內(nèi)相關(guān)蛋白，引起宿主細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，還可以通過影響宿主的免疫功能逃避宿主對轉(zhuǎn)化細胞的免疫監(jiān)視作用，造成HPV16的持續(xù)感染。持續(xù)性的高危型HPV感染是宮頸癌的重要原因。E6、E7蛋白使促炎性細胞因子，如白介素-18（IL-18）、IL-8和單核細胞趨化蛋白-1和巨噬細胞炎性蛋白-3α等趨化因子表達下降，并能使抗炎分子IL-18結(jié)合蛋白高表達［14］，進而抑制免疫反應(yīng)。E6、E7蛋白能通過操縱細胞內(nèi)信號通路來抑制抗病毒轉(zhuǎn)錄因子的活化，包括核因子-κB（NF-κB）和干擾素等［15］。有研究表明，E7蛋白能通過改變核易位和p65乙?；饔脕碜钄郚F-κB的活化，進而降低咪喹莫特對HPV16病毒感染的治療效果［16］。

隨著科技的進步宮頸癌的治療方法（手術(shù)、放療、化療技術(shù)）在不斷提高，但每年仍然有成千上萬的人死于宮頸癌［17］?，F(xiàn)已有默克公司針對HPV6/16/18的四價疫苗和葛蘭素史克公司針對HPV16/18的二價疫苗通過美國食品藥物監(jiān)督管理局審批，予以上市投入使用［18］。但這些預防性疫苗開始使用的時間建議在無性生活前（12歲前），接種對象是未被HPV感染的健康人群，且對已感染相關(guān)HPV的女性無治療效果［19］。因此，迫切需要研發(fā)針對已感染HPV人群的治療性疫苗。宮頸癌HPV治療性疫苗是指通過機體的免疫作用消除或減少體內(nèi)已被HPV感染的細胞，從而減少宮頸上皮內(nèi)瘤變或?qū)m頸癌的發(fā)生。E7腫瘤蛋白是一種外源性蛋白，僅在HPV感染的細胞中高表達［20］，且是宮頸癌發(fā)生過程中必不可少的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。這些特性使得E7蛋白成為最適合的治療性HPV疫苗的特異性靶抗原［21］。目前治療性HPV疫苗的研制雖已經(jīng)取得一定成果。Trimble等［22］已證實，針對HPV16 E6、E7蛋白的DNA疫苗VGX-3100疫苗對HPV16和HPV18感染所致的中、重度宮頸上皮內(nèi)瘤變治療效果顯著，為宮頸上皮內(nèi)瘤變患者提供了除手術(shù)治療外的治療方案。治療性疫苗的形式多樣化，除vgx-3100 類DNA疫苗外，還有肽類疫苗、蛋白疫苗、載體疫苗及細胞疫苗等。但治療性疫苗仍有許多問題需要改善，比如怎樣提高疫苗的安全性和提高疫苗的免疫原性等。

不同HPV亞型間的E7蛋白具有同源性。當E7與RAS蛋白結(jié)合時，能使其保持低表達水平，減弱其誘導細胞衰老的過程，從而導致細胞過度增殖；有研究發(fā)現(xiàn)，當E7蛋白在HPV16感染細胞中持續(xù)表達時，可使永生化細胞的端粒酶活性的穩(wěn)定性進一步增高［23］。PT-3可通過抑制感染HPV的CaSki細胞表達E6、E7來誘導細胞凋亡的發(fā)生。PT-3能使CaSki和Hela的生長動力減緩，然而這一作用對HPV陰性的C33A細胞無效［24］。而E2蛋白針對E7蛋白與其他細胞內(nèi)蛋白的關(guān)系仍在探索中。

當敲除CaSki細胞的HPV16 E6和E7基因后，宮頸癌CaSki細胞增殖受到抑制，能促進宮頸癌CaSki細胞凋亡，并降低宮頸癌CaSki細胞遷移和侵襲的能力［25］。

綜上所述，E7蛋白作為HPV16 E7基因編碼的關(guān)鍵腫瘤蛋白，在宮頸癌細胞生長、增殖、遷移及細胞周期調(diào)控等方面起著重要作用，與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關(guān)。因為HPV16 E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個線性B細胞表位、CD4+T細胞表位和CD4+CTL表位，與MHC分子親和力高，具有很好的抗原性；僅在HPV16感染的細胞中表達，屬于外源性蛋白；E7蛋白可在宿主細胞表面持續(xù)性表達，因為E7的持續(xù)性表達使其抗原性得以持續(xù)存在，這些因素都使得E7蛋白成為研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。雖然HPV治療性疫苗的研發(fā)和使用仍會面臨許多挑戰(zhàn)，但隨著科技的發(fā)展，針對E7的治療性HPV疫苗的進一步研發(fā)，對控制HPV感染所致子宮頸癌的發(fā)病率有著跨時代的作用。

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（2015-10-23）