沈 皓，呼圣娟，師紅利，姜榮興，賀嬋嬋，張 蓉

·論著·

沉默c-met基因表達對胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細胞生物學(xué)行為的影響

沈 皓，呼圣娟，師紅利，姜榮興，賀嬋嬋，張 蓉

【摘要】背景胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細胞(XGC9811-L)是本實驗組在前期工作中建立的一株具有肝臟高轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細胞系，c-met基因在其中高表達。c-met是肝細胞生長因子(HGF)的受體。目的研究沉默c-met基因表達對XGC9811-L的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。方法2014年1—6月，采用細胞轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pSuppressorRetro-c-met-siRNA導(dǎo)入XGC9811-L，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，按有無轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染目的基因的不同分為未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組和siRNA組。采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法檢測XGC9811-L中c-met mRNA相對表達水平，Western blotting法檢測c-met相對表達水平，通過細胞增殖實驗檢測各組細胞增殖能力并繪制細胞生長曲線，通過侵襲實驗和運動實驗計算各組穿膜細胞數(shù)。結(jié)果siRNA組c-met mRNA、c-met相對表達水平低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組(P<0.05)。siRNA組第3天、第5天、第6天、第7天細胞增殖能力低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組(P<0.05)。在侵襲實驗中，siRNA組穿膜細胞數(shù)少于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組(P<0.05)。在運動實驗中，siRNA組穿膜細胞數(shù)少于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組(P<0.05)。結(jié)論沉默c-met基因的表達可以抑制XGC9811-L的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，c-met在胃癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用，抑制c-met基因表達可能會抑制胃癌細胞向肝臟轉(zhuǎn)移。

胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細胞(XGC9811-L)是本實驗組在前期工作中建立的一株具有肝臟高轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細胞系，c-met基因在其中高表達[1]。c-met是肝細胞生長因子(HGF)的受體。為驗證c-met基因在XGC9811-L中的作用，本研究運用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)下調(diào)XGC9811-L中c-met水平，阻斷HGF/c-met傳導(dǎo)通路，研究沉默c-met基因表達對XGC9811-L的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和運動能力的影響。

1材料與方法

1.1一般材料

1.1.1細胞來源XGC9811-L由第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物國家重點實驗室建立并保存[1]。

1.1.2主要試劑RPMI 1640細胞培養(yǎng)液購于美國Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人c-met單克隆抗體購于Santa公司，山羊抗兔IgG二抗、β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；OMEGA總RNA提取試劑盒購于西安潤徳生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；重組質(zhì)粒pSuppressorRetro-c-met-siRNA(反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒和目的片段siRNA-Met連接的重組質(zhì)粒，位點為537的靶序列)和兼嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系(PhoenixA細胞)購于威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司；Trizol試劑盒購于Invitrogen公司。

1.2研究方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染法2014年1—6月，采用細胞轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pSuppressorRetro-c-met-siRNA導(dǎo)入PhoenixA細胞。PhoenixA細胞按l×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞80%融合備用。DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的制備方法：1～2 μg重組質(zhì)粒pSuppressorRetro-c-met-siRNA稀釋在1 ml 無血清RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，震蕩1 s，加人5～10 μl脂質(zhì)體懸液，再次震蕩混勻，室溫下溫育5～10 min。轉(zhuǎn)染步驟：吸去PhoenixA細胞培養(yǎng)上清液，用無血清RPMI 1640細胞培養(yǎng)液清洗2次，棄培養(yǎng)液，每孔加人1 ml DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，于CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)溫育3～5 h；每孔加入1 ml 含20% 胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，于CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)溫育48 h，收集含病毒的上清液(由PhoenixA細胞短暫表達)，立即用于感染靶細胞或于-70 ℃凍存。

1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立與分組將目的基因(pSuppressorRetro-c-met-siRNA)、空載體(pSuppressorRetro)、隨機序列(pSuppressorRetro-random)分別轉(zhuǎn)染入XGC9811-L，方法如下：將生長良好的1×105/ml的XGC9811-L接種于60 mm2平皿中，1 d后換新鮮的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液并加入1 ml含病毒的上清液，加慢病毒感染增強劑Polybrene至終濃度為8 μg/ml，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后用新鮮含病毒的上清液重復(fù)感染XGC9811-L，共重復(fù)感染3次，每次間隔24 h，最后1次培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，換含G418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d更換選擇培養(yǎng)基1次，7～10 d形成細胞克隆，將細胞克隆擴增、凍存。按有無轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染目的基因的不同分為未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組和siRNA組。

1.2.3熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法檢測XGC9811-L中c-met mRNA相對表達水平轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞，按Trizol試劑盒操作說明書提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物進行熒光定量RT-PCR，以GAPDH為內(nèi)源性對照，c-met上游引物為5′-AATACGTGACGTAGAAAGTA-3′，下游引物為5′-CATGGCTCTAGTTGTCGAC-3′，擴增片段200 bp。GAPDH上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段121 bp。PCR條件：94 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火延伸30 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并對凝膠成像進行分析，采用Photoshop16.0軟件分析c-met mRNA相對表達水平，實驗重復(fù)5次，取其均值。

1.2.4Western blotting法檢測c-met相對表達水平培養(yǎng)各組細胞至對數(shù)期，分別取其蛋白樣品20 μl，采用Western blotting法檢測c-met相對表達水平：以12%聚丙烯酰胺為分離膠，濃縮膠水平為5%，電泳完畢后經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)至聚乙烯二氟(PVDF)膜上，用10%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h；以β-actin抗體為內(nèi)參，分別滴加一抗(兔抗人c-met單克隆抗體，1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST緩沖液洗5次，5 min/次，滴加二抗(山羊抗兔IgG二抗)，室溫孵育2 h；最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色5 min，用成像儀拍照記錄。采用Photoshop16.0軟件分析c-met相對表達水平，實驗重復(fù)5次，取其平均值。

1.2.5細胞增殖實驗取各組XGC9811-L，按照3×103/孔接種于96孔板，每組做3個復(fù)孔，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至細胞貼壁；在第1～7天，每天每種細胞各取出3孔進行計數(shù)；每孔加入20 μl 噻唑藍貯存液〔四甲基唑藍(MTT) 5 mg/ml〕，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；將培養(yǎng)上清液置換成200 μl二甲基亞砜(Demso)，溶解藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)產(chǎn)物；設(shè)置僅含培養(yǎng)液的孔作為空白對照，用于調(diào)零；在酶聯(lián)免疫檢測儀吸光度(OD)為 490 nm處讀取OD值；以時間為橫坐標，3復(fù)孔的平均OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線；各組細胞培養(yǎng)第7天，比較各組細胞增殖能力。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.6侵襲實驗和運動實驗用人工基底膜膠Matrigel包被Transwell小室底部，4 ℃風(fēng)干(運動實驗不需此步驟)。將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加入400 μl按1∶1混合的不含血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液和含有10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)各組細胞至對數(shù)期，消化各組細胞，1 000 r/min離心5 min(離心半徑為3 cm)，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含1%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×105/ml，每組重復(fù)4個樣本。侵襲實驗常規(guī)培養(yǎng)48 h，運動實驗培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細胞，95%甲醇溶液固定15 min，Gimsa溶液染色。在顯微鏡(×100)下隨機挑取10個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)5次，取其平均值。

2結(jié)果

2.1各組c-met mRNA相對表達水平比較各組c-met mRNA相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。siRNA組c-met mRNA相對表達水平低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。

2.2各組c-met相對表達水平比較各組c-met相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。siRNA組c-met相對表達水平低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖2)。

2.3各組細胞增殖能力比較各組第1天、第2天、第4天細胞增殖能力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組第3天、第5天、第6天、第7天細胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。siRNA組第3天、第5天、第6天、第7天細胞增殖能力低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖3)。

2.4各組穿膜細胞數(shù)比較在侵襲實驗中，各組穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siRNA組穿膜細胞數(shù)少于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在運動實驗中，各組穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siRNA組穿膜細胞數(shù)少于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

3討論

本研究利用siRNA技術(shù)沉默了XGC9811-L中c-met基因的表達，并進一步通過細胞增殖實驗和轉(zhuǎn)移相關(guān)的體外實驗證實，缺少了c-met基因的XGC9811-L在細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面明顯受到抑制。

本研究選擇針對c-met基因537靶序列的siRNA進行實驗，將c-met-siRNA轉(zhuǎn)染入XGC9811-L中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，熒光定量RT-PCR法、Western blotting法結(jié)果顯示，siRNA組c-met mRNA、c-met相對表達水平均低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，證實所建立的XGC9811-L /c-met-siRNA細胞系成功地沉默了c-met基因的表達。

Table 1Comparison of the relative expression levels of c-met mRNA and c-met among the four groups

組別c-metmRNA/GAPDHβ-actin/c-met未轉(zhuǎn)染組0.71±0.07a1.18±0.09a空載體組0.67±0.08a1.36±0.08a隨機序列組0.71±0.05a1.24±0.16asiRNA組0.32±0.022.38±0.16F值46.424112.376P值<0.001<0.001

注：與siRNA組比較，aP<0.05；siRNA=小干擾RNA

注：siRNA=小干擾RNA

圖14組c-met mRNA熒光定量RT-PCR結(jié)果

Figure 1Results of fluorescent quantitation RT-PCR of the four groups

圖2　4組c-met Western blotting法結(jié)果

組別第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天未轉(zhuǎn)染組0.28±0.010.37±0.010.44±0.05a0.55±0.070.69±0.01a0.76±0.02a0.90±0.01a空載體組0.28±0.030.38±0.040.49±0.02a0.55±0.060.66±0.06a0.75±0.01a0.80±0.02a隨機序列組0.28±0.020.38±0.030.49±0.04a0.55±0.060.65±0.03a0.74±0.02a0.86±0.02asiRNA組0.27±0.020.34±0.030.37±0.020.44±0.030.51±0.030.58±0.120.58±0.03F值0.1170.9377.1553.34111.2364.94788.931P值0.9470.4670.0120.0770.0030.031<0.001

注：與siRNA組比較，aP<0.05

注：OD=吸光度

圖34組細胞生長曲線

Figure 3Cell growth curves of the four groups

Table 3Comparison of the number of transmembrane cells among the four groups

組別侵襲實驗穿膜細胞數(shù)運動實驗穿膜細胞數(shù)未轉(zhuǎn)染組31.2±6.3a44.6±5.7a空載體組29.8±2.4a42.4±3.2a隨機序列組30.3±1.7a39.5±2.6asiRNA組16.4±3.924.2±4.4F值13.25415.596P值<0.001<0.001

注：與siRNA組比較，aP<0.05

HGF/c-met通路廣泛存在于多種細胞中，參與調(diào)節(jié)組織器官的正常生長發(fā)育[2]。近年在惡性腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)HGF、c-met表達水平增加，HGF與c-met結(jié)合并持續(xù)激活HGF/c-met通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良[3]。Gardner等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HGF受體c-met在黑色素細胞中的表達能夠增強黑色素瘤細胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力。Krause等[5]研究表明，c-met通路與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且c-met水平越高，在部分肝切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率越高。在胃癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究中，Lee等[6]利用免疫組化法檢測到c-met在胃癌肝轉(zhuǎn)移組織中的表達水平高于胃癌組織。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA組第3天、第5天、第6天、第7天細胞增殖能力低于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組；siRNA組穿膜細胞數(shù)均少于未轉(zhuǎn)染組、空載體組、隨機序列組，提示siRNA組XGC9811-L在細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面均受到抑制，且c-met基因在胃癌肝轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。

本研究只是在細胞水平進行了轉(zhuǎn)移相關(guān)的體外實驗，不能有效證實c-met基因是否與胃癌肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)，需要進一步的體內(nèi)實驗來驗證。

綜上所述，缺少c-met基因的XGC9811-L在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面均受到抑制，提示c-met基因在胃癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用，抑制c-met基因表達可能會抑制胃癌細胞向肝臟轉(zhuǎn)移。

作者貢獻：呼圣娟負責(zé)實驗設(shè)計、評估、審校并對文章負責(zé)；沈皓、師紅利、賀嬋嬋、張蓉負責(zé)實驗具體實施，沈皓、姜榮興負責(zé)收集資料和整理，并撰寫論文。

本文無利益沖突。

參考文獻

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[5]Krause P,Flikweert H,Monin M,et al.Increased growth of colorectal liver metastasis following partial hepatectomy[J].Clin Exp Metastasis,2013,30(5):681-693.

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(本文編輯：崔麗紅)

【關(guān)鍵詞】RNA,小分子干擾；基因沉默；原癌基因蛋白質(zhì)c-met；XGC9811-L

沈皓，呼圣娟，師紅利，等 .沉默c-met基因表達對胃癌肝高轉(zhuǎn)移潛能細胞生物學(xué)行為的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(3)：296-299.[www.chinagp.net]

Shen H,Hu SJ,Shi HL,et al.Effects of silencing of c-met gene expression on biological behavior of gastric cancer cells with high liver-metastatic potential[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：296-299.

Effects of Silencing of c-met Gene Expression on Biological Behavior of Gastric Cancer Cells With High Liver-metastatic PotentialSHENHao,HUSheng-juan,SHIHong-li,etal.DepartmentofGastroenterology,theFirstPeople′sHospitalofYinchuan,Yinchuan750001,China

【Abstract】BackgroundXGC9811-L,which is a gastric cancer cell line with high liver-metastatic potential,was established in the preliminary work of the study.The expression of c-met is higher in XGC9811-L than in other gastric cancer cell lines,and c-met is the receptor of hepatocyte growth factor.ObjectiveTo research the effects of silencing of c-met gene expression on biological behaviors of XGC9811-L,such as proliferation,invasion and metastasis.MethodsFrom January to June 2014,using cell transfection method,we imported recombinant plasmid pSuppressorRetro-c-met-siRNA into XGC9811-L cells and built stable transfection cell lines.Based on whether transfection was made and the difference in the target genes of transfection,the stable transfection cell lines were divided into four groups:non-transfection group,empty carrier group,random sequence group and siRNA group.Fluorescent quantitation RT-PCR method was adopted to detect the relative expression level of c-met mRNA in XGC9811-L;c-met relative expression was measured by western blotting method.By cell proliferation assay,the cell proliferation ability of each group was detected,and cell growth curves were drawn.Invasion assay and movement experiment were conducted to calculate the number of transmembrane cells of each group.ResultssiRNA group was lower than the other three groups in the relative expression levels of c-met mRNA and c-met (P<0.05).siRNA group was lower than the other three groups in cell proliferation ability on day 3,day 5,day 6 and day 7 (P<0.05).In invasion assay,siRNA group was less than the other three groups in the number of transmembrane cells (P<0.05).In movement experiment,siRNA group was less than other three groups in the number of transmembrane cells (P<0.05).ConclusionSilencing of c-met gene expression can inhibit the proliferation,invasion and metastasis of XGC9811-L,and c-met may play an important part in the occurrence and development of gastric hepatic metasis.The inhibition of c-met expression can inhibit the metastasis of gastric cancer cell to liver.

【Key words】RNA,small interfering；Gene silencing；Proto-oncogene proteins c-met；XGC9811-L

(收稿日期：2015-06-27；修回日期：2015-11-06)

【中圖分類號】R 735.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.011

通信作者：呼圣娟，750000 寧夏銀川市，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科；E-mail：hsj.judy@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81060193)；寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ1283)
作者單位：750001寧夏銀川市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(沈皓)，放射科(姜榮興)；寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(呼圣娟，師紅利，賀嬋嬋，張蓉)