李 萍，方 霞，曹雨娜，陸惠娜，梁愛斌，張 虹

·論著·

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白74B對纖毛生成和細(xì)胞周期調(diào)控作用研究

李 萍，方 霞，曹雨娜，陸惠娜，梁愛斌，張 虹

【摘要】背景卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(CCDC)參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期過程，并調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為，然而多數(shù)CCDC的生物學(xué)功能目前尚未明確。目的探討CCDC74B的細(xì)胞定位及對纖毛生成和細(xì)胞周期的影響。方法2013年3—9月通過構(gòu)建在人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE1)中的Tet-On表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)CCDC74B在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá),然后通過細(xì)胞免疫熒光染色觀察CCDC74B的細(xì)胞定位，通過小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染敲除CCDC74B在RPE1細(xì)胞中的表達(dá)，分為對照組、siRNA#1組、siRNA#2組，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測CCDC74B mRNA 表達(dá)水平；采用細(xì)胞免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)觀察下調(diào)CCDC74B表達(dá)后纖毛生成情況和對細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果在正常上皮細(xì)胞中，CCDC74B位于中心體，細(xì)胞免疫熒光染色示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后細(xì)胞初級(jí)纖毛生成。siRNA#1組及siRNA#2組轉(zhuǎn)染后36 h及48 h纖毛生成率分別高于對照組(P<0.05)。RT-PCR法結(jié)果顯示,siRNA#1組及siRNA#2組均有效抑制了CCDC74B mRNA表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后cyclin A表達(dá)減少，提示存在細(xì)胞周期停滯；流式細(xì)胞術(shù)檢測示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后G1期細(xì)胞比例增高，S期及G2/M期細(xì)胞比例減少。結(jié)論中心體蛋白CCDC74B在細(xì)胞增殖過程中參與對纖毛生成和細(xì)胞周期的調(diào)控。

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(CCDC)是其序列中存在一個(gè)或數(shù)個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域而被命名的一類蛋白[1]。CCDC結(jié)構(gòu)折疊形式多變，可通過空間構(gòu)象改變而實(shí)現(xiàn)許多不同的分子生物學(xué)功能，對細(xì)胞再生和存活、在細(xì)胞及分子的相互識(shí)別過程中起著確定性的作用。已有研究表明，部分CCDC參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期過程，并調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為[2-3]。CCDC有百余種，然而多數(shù)蛋白生物學(xué)功能目前尚未知。本研究首先通過構(gòu)建在人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE1)細(xì)胞中的Tet-On表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的CCDC74B表達(dá)，使用細(xì)胞免疫熒光染色方法觀察CCDC74B的細(xì)胞定位；然后通過小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染敲除CCDC74B表達(dá)后觀察細(xì)胞纖毛生成及細(xì)胞周期變化情況，以初步探討CCDC74B在細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

1材料與方法

1.1試劑與抗體DMEM/F-12培養(yǎng)基、 胎牛血清、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒及LipofectamineTMLTX轉(zhuǎn)染試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；抗cyclin A抗體、細(xì)胞周期碘化丙啶(PI)/RNase染色液為美國BD公司產(chǎn)品；抗Myc抗體(9E10)為瑞士Roche公司產(chǎn)品；抗乙?；痶ubulin抗體(6-11B-1)、抗tubulin抗體為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)2013年3—9月，RPE1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。RPE1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3利用Tet-On表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CCDC74B的RPE1細(xì)胞株Tet-On表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建過程參照Inoko等[4]報(bào)道，進(jìn)行相同操作。具體步驟如下：將CCDC74B DNA亞克隆至pENTR4-Myc載體，構(gòu)建pENTR4-Myc-CCDC74B質(zhì)粒，然后再通過LR重組反應(yīng)將Myc-CCDC74B克隆至Tet應(yīng)答的慢病毒載體pCSII-TRE-Tight-RfA(從Inakaki教授研究室獲得)。重組后的pCSII-TRE-Tight-RfA-Myc-CCDC74A/B質(zhì)粒通過慢病毒感染Tet-On RPE1細(xì)胞，并使用G418(250 μg/ml)和潮霉素B(50 μg/ml)雙重篩選感染細(xì)胞。在細(xì)胞株建立后，使用適量多西環(huán)素(doxycycline，DOX)誘導(dǎo)CCDC74B在RPE1細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞免疫熒光染色觀察CCDC74B細(xì)胞定位、纖毛形成和cyclin A 表達(dá)情況將RPE1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)于底部放置載玻片的培養(yǎng)皿中,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，使用100%甲醇或3.7%甲醛溶液固定細(xì)胞,后者固定的細(xì)胞需予以0.1% Triton X-100通透5 min。然后予以1%牛血清清蛋白(BSA)封閉1 h后，分別加入抗Myc抗體、抗乙?；⒐艿鞍?ac-tubulin)抗體、抗tubulin抗體及抗cyclin A抗體孵育1 h或4 ℃過夜；孵育熒光二抗后，最后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，封固，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5siRNA合成及計(jì)算纖毛生成率從Qiagen公司購買敲除CCDC74B基因兩種不同的siRNA序列#1(siRNA#1組)和#2(siRNA#2組)及control siRNA(對照組)，具體序列如下:siRNA#1:CAGACAGCCTCTCCACGTCAA，siRNA#2:CACGTTACA

AGCTCATAATGA；Control siRNA:TTCTCCGAACGTGTC

ACGT。使用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)RPE1細(xì)胞24 h后,適量siRNA與LipofectamineTMLTX及PLUSTM試劑混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞36 h和48 h,觀察纖毛生成情況。觀察100個(gè)細(xì)胞中纖毛生成個(gè)數(shù)，計(jì)算纖毛生成率。

1.6RT-PCR法檢測CCDC74B mRNA 表達(dá)收集siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的RPE1細(xì)胞，使用Trizol一步法從細(xì)胞中抽提總RNA，取2 μg總RNA通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)DNA(cDNA)片段，反轉(zhuǎn)錄體系：(1)OligodT Primer 1 μl,dNTP Mixture 1 μl,RNase free 蒸餾水(dH2O)6.0 μl,RNA 2.0 μg；65 ℃ 5 min；(2)10×RT Buffer 2.0 μl,25 mmol/L氯化鎂(MgCl2) 4 μl,0.1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)2 μl,RNaseOut 1 μl,SuperScript Ⅲ RT 1.0 μl,RNase free dH2O 4.5 μl,50 ℃×50 min,85 ℃×5 min；(3)RNase H 1 μl 37 ℃ 20 min；PCR反應(yīng)體系為：E×Taq Polymerase 0.25 μl上下游引物(CCDC74B或內(nèi)參基因GADPH)各2 μl，10×Reaction Buffer 5.0 μl,模板1.0 μl,重蒸水(ddH2O)35.75 μl。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性10 s；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s,30 個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照，觀察。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化收集siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的RPE1細(xì)胞，使用Cycle test Plus kit試劑盒，對DNA進(jìn)行PI染色。待流式細(xì)胞儀檢測后，使用CellQuest軟件分析計(jì)算各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)目。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞免疫熒光染色觀察CCDC74B細(xì)胞定位在RPE1細(xì)胞中成功構(gòu)建了表達(dá)帶有Myc標(biāo)記的人類基因CCDC74B(Myc-CCDC74B)的Tet-On表達(dá)系統(tǒng)。使用DOX(25 ng/ml)預(yù)處理24 h，在誘導(dǎo)Myc-CCDC74B在RPE1細(xì)胞中蛋白表達(dá)后,使用抗tubulin抗體與抗Myc抗體進(jìn)行雙重細(xì)胞免疫熒光染色觀察到CCDC74B的綠色熒光與tubulin的紅色熒光重合而變色，提示CCDC74B在細(xì)胞分裂間期位于中心體(見圖1，本文圖1～4彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.2下調(diào)RPE1細(xì)胞中的CCDC74B表達(dá)對細(xì)胞纖毛生成的影響細(xì)胞免疫熒光染色示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后細(xì)胞初級(jí)纖毛生成(見圖2)。siRNA#1組及siRNA#2組轉(zhuǎn)染后36 h及48 h纖毛生成率分別高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表1)。

2.3RT-PCR法檢測RPE1細(xì)胞內(nèi)CCDC74B mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染RPE1細(xì)胞48 h后采用RT-PCR法檢測RPE1細(xì)胞內(nèi)CCDC74B mRNA表達(dá)水平,siRNA#1組及siRNA#2組均有效抑制了CCDC74B mRNA表達(dá)(見圖3)。

2.4下調(diào)CCDC74B表達(dá)對細(xì)胞周期的影響細(xì)胞免疫熒光染色示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后cyclin A表達(dá)減少(見圖4)，提示存在細(xì)胞周期停滯；流式細(xì)胞術(shù)檢測示，下調(diào)CCDC74B表達(dá)后G1期細(xì)胞比例增高，S期及G2/M期細(xì)胞比例減少(見圖5)。

3討論

CCDC74B基因位于人類染色體2q21.1,蛋白質(zhì)序列有一個(gè)CCDC結(jié)構(gòu)域，目前尚未見關(guān)于該基因生物學(xué)功能的文獻(xiàn)報(bào)道。由于局限于目前市場上尚無用于細(xì)胞免疫熒光染色的該蛋白抗體，本研究通過構(gòu)建在RPE1細(xì)胞中的Tet-On表達(dá)系統(tǒng),使用DOX誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)CCDC74B(Myc-CCDC74B)的穩(wěn)定表達(dá)，然后通過抗Myc抗體的細(xì)胞免疫熒光染色法觀察CCDC74B的細(xì)胞定位。本研究結(jié)果表明，CCDC74B位于中心體。由于中心體蛋白在初級(jí)纖毛生成、細(xì)胞分裂等細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)揮重要作用，因此本研究進(jìn)一步探討了CCDC74B對纖毛生成及細(xì)胞周期的影響，研究發(fā)現(xiàn),在正常增殖的細(xì)胞中，抑制CCDC74B表達(dá)后誘導(dǎo)了初級(jí)纖毛的生成，提示CCDC74B可能為纖毛生成的負(fù)調(diào)控因子。

圖1細(xì)胞免疫熒光染色觀察Myc-CCDC74B Tet-On RPE1細(xì)胞中CCDC74B細(xì)胞定位

Figure 1CCCD74B intercellular localization was observed through immunofluorescence in Myc-CCDC74B Tet-On RPE1 cells

圖2　siRNA下調(diào)CCDC74B表達(dá)后誘導(dǎo)RPE1細(xì)胞初級(jí)纖毛生成

Figure 2Knockdown of CCDC74B caused primary cilia formation in RPE1 cells

Table 1Comparison of the percentages of ciliated cells observed 36 and 48 hours after transfection among control group,siRNA#1 group and siRNA#2 group

組別36h48h對照組4.3±0.63.3±1.2siRNA#1組38.3±2.1a35.3±2.5asiRNA#2組64.0±6.2a59.3±3.8aF值184.634322.909P值<0.001<0.001

注：siRNA=小干擾RNA；與對照組比較，aP<0.01

圖3　CCDC74B mRNA表達(dá)電泳圖

圖4細(xì)胞免疫熒光染色檢測CCDC74B表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞cyclin A表達(dá)情況

Figure 4Expression of cyclin A after the decrease of CCDC74B expression observed by immunofluorescence staining

圖5　流式細(xì)胞術(shù)檢測CCDC74B表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞周期分布情況

Figure 5Cell cycle distribution after the decrease of CCDC74B expression detected by FCM

初級(jí)纖毛幾乎存在于所有的人類細(xì)胞類型中，是突出細(xì)胞表面的“毛發(fā)狀”細(xì)胞器，由中心體一中心粒(即母中心粒)轉(zhuǎn)化成基體而形成。初級(jí)纖毛和細(xì)胞周期有著密切的聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞退出細(xì)胞周期，進(jìn)入G0期，纖毛則出現(xiàn)；而當(dāng)靜止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，纖毛則被吸收，并在細(xì)胞增殖過程中不再出現(xiàn)，這種吸收利于釋放中心體，使其形成紡錘體極，保證染色體在細(xì)胞分裂時(shí)的精確分離[5-6]。然而，在細(xì)胞增殖過程中纖毛形成受抑制的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，Aurora A激酶在G0/G1期通過在基體部位和HEF1結(jié)合，特異性激活 HDAC6的微管蛋白去乙?；钚?，導(dǎo)致纖毛軸絲的解體[7]。Inoko等[4]研究發(fā)現(xiàn)，多毛蛋白Trichoplein與Aurora A激酶結(jié)合，在細(xì)胞增殖中抑制纖毛的生長。另一研究發(fā)現(xiàn)，CP110在Cep97和Kif24的作用下在細(xì)胞分裂間期位于母中心粒末端，抑制纖毛的生長，機(jī)制可能是通過和Cep290結(jié)合，抑制Rab8a在纖毛形成中的功能[8-9]。最新研究表明，S/G2期激酶Nek2可通過對 Kif24磷酸化改變其活性而抑制纖毛的生成[10]。CCDC74B則是本研究首次報(bào)道的在增殖細(xì)胞中抑制纖毛生成的另一個(gè)調(diào)控蛋白，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

近年研究發(fā)現(xiàn)，在一些增殖細(xì)胞中初級(jí)纖毛的異常出現(xiàn)或長度異常能阻滯細(xì)胞周期[4,7,11-12]，提示纖毛本身也是調(diào)控細(xì)胞周期的“制動(dòng)器”。 細(xì)胞無限制地增生是惡性腫瘤的重要特性之一，而且在許多類型惡性腫瘤細(xì)胞中不存在纖毛，因此在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)纖毛生長的治療方法有望成為某些類型惡性腫瘤治療的新途徑。最近已有研究發(fā)現(xiàn)，在原代人類膽管癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)纖毛的生成能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長[10,13]。 本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CCDC74B表達(dá)也導(dǎo)致了G1期停滯，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的表型一致，提示CCDC74B下調(diào)所致的細(xì)胞周期停滯可能與初級(jí)纖毛生成相關(guān)。

綜上所述，在正常增殖細(xì)胞中，CCDC74B位于中心體，下調(diào)CCDC74B表達(dá)誘導(dǎo)了初級(jí)纖毛的生成，并致細(xì)胞周期停滯于G1期，提示中心體蛋白CCDC74B可能通過對纖毛生成的調(diào)控參與細(xì)胞增殖過程。本研究中筆者揭示了CCDC74B在纖毛生成和細(xì)胞周期調(diào)控方面的生物學(xué)功能，也為纖毛相關(guān)性疾病的機(jī)制和治療提供了相關(guān)線索。

作者貢獻(xiàn)：李萍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；方霞、曹雨娜、陸惠娜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；梁愛斌、張虹進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

【關(guān)鍵詞】卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白；纖毛；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖

李萍，方霞，曹雨娜，等.卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白74B對纖毛生成和細(xì)胞周期調(diào)控作用研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(3)：292-295.[www.chinagp.net]

Li P，F(xiàn)ang X,Cao YN,et al.Regulatory effect of CCDC74B on cilia formation and cell cycle[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：292-295.

Regulatory Effect of CCDC74B on Cilia Formation and Cell CycleLIPing，F(xiàn)ANGXia,CAOYu-na,etal.DepartmentofHematology,TongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China

【Abstract】BackgroundCCDC protein is involved in various biological behaviors including gene transcription,apoptosis,cell cycle and regulating invasion and metastasis of cancer cells.However,most CCDC protein functions remain unknown.ObjectiveTo investigate the cellular localization and its influence on cilia formation and cell cycle.MethodsFrom March to September in 2013,Tet-On expression system of RPE1 was built,and protein expression of CCDC74B was realized.The localization of exogenous CCDC74B was observed by immunofluorescence.After siRNA transfection was performed to decrease endogenous CCDC74B protein expression in RPE1 cells,the cells were divided into control group,siRNA#1 group and siRNA#2 group.RT-PCR method was used to detect CCDC74B mRNA expression.Cilia formation and cell cycle distribution after the decrease of CCDC74B expression were further observed by immunofluorescent staining and flow cytometry.ResultsIn normal epithelial cells,CCDC74B was in centrosome,and immunofluorescent staining showed that the decrease of CCDC74B leaded to the elementary cilia formation.36 h and 48 h after transfection,siRNA#1 group and siRNA#2 group were higher than control group in the proportion of ciliated cells(P<0.05).RT-PCR method showed that siRNA#1 group and siRNA#2 group effectively inhibited the expression of CCDC74B mRNA.The immunofluorescent staining showed that after the decrease of CCDC74B expression,the expression of cyclin A decreased,which suggested that cell cycle arrest may exist.FCM suggested that the decrease of CCDC74B leaded to the increase of the proportion of G1cells and the decrease of the proportion of cells at S and G2/M phrases.ConclusionCentrosomal protein CCDC74B is involved in the regulation of cilia formation in the process of cell proliferation.

【Key words】Coiled-coil domain containing；Cilia；Cell cycle；Cell proliferation

(收稿日期：2015-08-10；修回日期：2015-12-15)

【中圖分類號(hào)】R 349.53

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.010

通信作者:張虹，200065 上海市，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科；E-mail：hongzh97@sina.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301118)
作者單位：200065 上海市，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科