孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對(duì)小鼠血清免疫因子水平以及免疫細(xì)胞增殖、活性的影響▲

孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

目的 探討凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對(duì)小鼠血清免疫因子水平以及免疫細(xì)胞增殖、活性的影響。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸癌CT26細(xì)胞制備凋亡、壞死腫瘤細(xì)胞。取Balb/c小鼠20只，分離T淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷(NK)細(xì)胞、獲取巨噬細(xì)胞，并制備細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。將小鼠CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分別經(jīng)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞處理后，均分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組，應(yīng)用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活性，細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)法檢測(cè)各組CTL、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖情況。另選取Balb/c小鼠分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組各10只，分別將凋亡、壞死、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT26細(xì)胞按通過皮下及靜脈輸注小鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組小鼠血清可溶性Fas(sFas)、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)水平。結(jié)果 與壞死腫瘤細(xì)胞組及腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，凋亡腫瘤細(xì)胞組中不同效靶比的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性均降低(P<0.05)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細(xì)胞組的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的A450值均低于壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。ELISA檢測(cè)顯示凋亡腫瘤細(xì)胞組sFas相對(duì)表達(dá)量低于壞死腫瘤細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組IL-4表達(dá)水平高于腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β表達(dá)水平則高于其他兩組(P<0.05)，IL-12表達(dá)水平低于其他兩組(P<0.05)。結(jié)論 凋亡大腸癌CT26細(xì)胞能夠抑制小鼠特異性CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖及其活性，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。

大腸癌；CT26細(xì)胞；細(xì)胞毒性T細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；可溶性Fas

大腸癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位[1]。我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率近年來(lái)持續(xù)上升，現(xiàn)已分別位居男性惡性腫瘤發(fā)病第5位和女性惡性腫瘤發(fā)病第3位[2]。過去幾十年中，在大腸癌治療方面上取得巨大進(jìn)步，且已形成手術(shù)治療加術(shù)后輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案[3]，同時(shí)近年來(lái)部分指南對(duì)不能耐受手術(shù)或者術(shù)后預(yù)期較差的患者，推薦使用西妥昔單抗單一療法或者聯(lián)合伊立替康(或鉑類)的聯(lián)合治療方案[4]。然而結(jié)直腸癌仍是全球癌癥死因的主要原因之一[5]，特別是由于我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)向西方轉(zhuǎn)變、肥胖及缺乏運(yùn)動(dòng)等因素，大腸癌的發(fā)病率和死亡率進(jìn)一步上升[6]。目前認(rèn)為影響大腸癌發(fā)生的主要因素是遺傳因素和環(huán)境因素[7]，而大腸癌患者機(jī)體的免疫功能改變主要包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)數(shù)量增高、腫瘤應(yīng)答的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性降低及對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，機(jī)體免疫監(jiān)視功能的降低與喪失被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生的主要表現(xiàn)。機(jī)體發(fā)生免疫監(jiān)視功能的降低與喪失的原因眾多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)凋亡腫瘤細(xì)胞也可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受[8]，而近期又有學(xué)者提示通過阻斷在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄活化因子3磷酸化可幫助腫瘤細(xì)胞免受機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的清除[9]。但目前凋亡腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤免疫耐受的機(jī)制未明。因此，本研究通過分析凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對(duì)小鼠血清免疫因子水平以及免疫細(xì)胞增殖、活性的影響，以探討凋亡腫瘤細(xì)胞與腫瘤免疫耐受的關(guān)系及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物 放線菌素D(美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：1102C035)；6%可溶性淀粉肉湯：在100 ml肉湯培養(yǎng)基[北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司，090216(PT-1)]中加入可溶性淀粉6 g，經(jīng)煮沸滅菌30 min，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)6～8周齡Balb/c小鼠50只，雄性，體重(240±30)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0015，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有小鼠均按無(wú)特定病原體級(jí)飼養(yǎng)，且所有實(shí)驗(yàn)均通過動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)證。

1.3 細(xì)胞株及主要試劑 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26.WT(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：20140331)、胰酶(美國(guó)Gibco公司，生產(chǎn)批號(hào)：1220087)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：141215)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：130422)等。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：311)，雙人超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)：BCM-1000)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，型號(hào)：CKX-31)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，型號(hào)：Centrifuge 5415R)；移液槍(芬蘭百得公司，型號(hào)：Genex，規(guī)格：20～200 μl)；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：BL-420S)等。

1.5 方法

1.5.1 CT26細(xì)胞的培養(yǎng)及凋亡、壞死腫瘤細(xì)胞的制備： 將CT26細(xì)胞用含10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，生產(chǎn)批號(hào)：14000-044)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，生產(chǎn)批號(hào)：120917)培養(yǎng)于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT26細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整密度為1×106細(xì)胞/孔。待細(xì)胞貼壁后加入含放線菌素D(200 ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)凋亡，用胰酶消化，收集懸液并依次加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120811)，混勻后室溫避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，富集，按不同濃度稀釋備用。另外取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT26細(xì)胞用加熱法(腫瘤細(xì)胞株56℃水浴1h)制備壞死腫瘤細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞的壞死形態(tài)改變并確定，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，按不同濃度稀釋備用。

1.5.2 動(dòng)物分組及CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的制備： 適應(yīng)性喂養(yǎng)Balb/c小鼠5～6 d后，取6～8周齡雄性Balb/c小鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為單個(gè)核細(xì)胞制備組及腹腔巨噬細(xì)胞制備組，每組10只。單個(gè)核細(xì)胞制備組的小鼠正常喂養(yǎng)，3 d后脫頸椎處死，取脾臟，去被膜，于200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800 r/min離心4 min后收集待分離細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，采用免疫磁珠分選法分別分離T細(xì)胞亞群與自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀鑒定其表型，分選出的陽(yáng)性細(xì)胞用熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體通過熒光激活細(xì)胞分離法(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)鑒定純度。將T淋巴細(xì)胞與凋亡腫瘤細(xì)胞按25 ∶1比例混勻，靜置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，4 d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。第2周起，每周加比例為10 ∶1的凋亡細(xì)胞1次，共3次。其中在第2次的第3天加入白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2(終濃度20 U/ml)，并每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)基。在第3次結(jié)束后，2 000 r/min離心5～10 min后收集細(xì)胞，即特異性CTL，計(jì)數(shù)、調(diào)整至合適濃度。給予腹腔巨噬細(xì)胞制備組的小鼠腹腔注射無(wú)菌的6% 淀粉肉湯1.0 ml，通過引發(fā)腹腔的非感染性炎癥而誘導(dǎo)腹腔外巨噬細(xì)胞移動(dòng)并聚集于腹腔。48 h后，被巨噬細(xì)胞吞噬的淀粉等微粒已消化殆盡，誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞尚屬于正常巨噬細(xì)胞，并具有活躍的吞噬功能。誘導(dǎo)2～3 d后處死，仰臥固定，常規(guī)消毒皮膚，開腹，用毛細(xì)吸管收集腹腔液，其中含豐富的巨噬細(xì)胞。計(jì)數(shù)、調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度。

1.5.3 免疫細(xì)胞的分組：將不同免疫細(xì)胞(CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)分別經(jīng)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞處理后，CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組3個(gè)亞組：(1)凋亡腫瘤細(xì)胞組：先將不同的免疫細(xì)胞各自與凋亡腫瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以兩組不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入靶細(xì)胞繼續(xù)孵育至4 h。(2)壞死腫瘤細(xì)胞組：先將不同的免疫細(xì)胞各自與壞死腫瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入靶細(xì)胞繼續(xù)孵育至4 h。(3)腫瘤細(xì)胞對(duì)照組：不同的免疫細(xì)胞各自與靶細(xì)胞以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)孵育至4 h。

1.5.4 免疫細(xì)胞活性檢測(cè)：采用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組的CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性，其中以相應(yīng)腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞并預(yù)先以Na251CrO4標(biāo)記，免疫細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。以上各組同時(shí)設(shè)自然釋放對(duì)照孔及最大釋放對(duì)照孔。分別取每組各孔上清，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射活性值(單位：cpm)。免疫細(xì)胞活性根據(jù)下式計(jì)算51Cr自然釋放率和免疫細(xì)胞活性：

1.5.5 免疫細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測(cè)鼠的NK、CTL、巨噬細(xì)胞增殖。分別將各組CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞按25 ∶1比例混勻鋪96孔板，細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，100 μl培基，每組3個(gè)復(fù)孔，96孔板邊上一圈的孔不鋪細(xì)胞，只加PBS用于調(diào)零。將培養(yǎng)板靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)前2 h加入每孔加入10 μl的CCK-8試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120503)，繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.5.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)水平：選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤壞死對(duì)照組各10只，各組通過皮下及靜脈注射相應(yīng)不同狀態(tài)(凋亡、壞死、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)的CT26細(xì)胞，皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量。分別經(jīng)尾靜脈采血約500 μl，待血自然凝固后，5 963 r/min離心10 min，吸取血清分裝凍存于-70℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。采用ELISA嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢測(cè)血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)水平。測(cè)定標(biāo)本A450值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，A值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)，通過標(biāo)本的A值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠體外CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性的抑制作用 3組的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞51Cr自然釋放率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與壞死細(xì)胞組及腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，凋亡腫瘤細(xì)胞組的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞不同效靶比的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性均降低(P<0.05)。見表1～3。

表1 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì) 小鼠體外CTL活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，#P<0.05。

表2 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì) 小鼠體外NK細(xì)胞活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，#P<0.05。

表3 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì) 小鼠體外巨噬細(xì)胞活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠NK細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞組的NK細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的A450值均低于壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，見表4。

表4 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì) 小鼠免疫細(xì)胞增殖活性的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.3 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠血清sFas表達(dá)以及小鼠血清IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞組sFas相對(duì)表達(dá)量低于壞死腫瘤細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，而壞死腫瘤細(xì)胞組的sFas相對(duì)表達(dá)量則高于正常腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組抗炎因子IL-4表達(dá)水平高于腫瘤細(xì)胞對(duì)照組而小于壞死腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)，抗炎因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平則高于其他兩組(P<0.05)，促炎因子IL-12表達(dá)水平低于其他兩組(P<0.05)，IFN-γ表達(dá)水平亦低于其他兩組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠血清sFas表達(dá)量及IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β含量的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討 論

近年來(lái)，細(xì)胞凋亡與機(jī)體免疫的關(guān)系，特別是細(xì)胞凋亡參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)成為研究熱點(diǎn)。Feig等[8]發(fā)現(xiàn)凋亡除了與機(jī)體免疫系統(tǒng)保持平衡和穩(wěn)定有密切的關(guān)系外，其更是機(jī)體主動(dòng)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一種重要方式，即凋亡具有免疫調(diào)節(jié)作用。Ravishankar等[9]發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞可以調(diào)節(jié)機(jī)體先天免疫系統(tǒng)，使得二級(jí)淋巴器官的哨兵吞噬細(xì)胞減少和免疫抑制通路被阻斷，從而達(dá)到減輕局部炎癥、產(chǎn)生自身耐受的效果，其將凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)的固有免疫抑制與凋亡細(xì)胞的免疫耐受形容為“上下文”般的依賴關(guān)系。Hassan等[10]則提出，傳統(tǒng)意義上認(rèn)為正常的細(xì)胞凋亡可以減少基因?qū)用娴哪[瘤發(fā)生，但往往腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)正常的細(xì)胞凋亡變異，進(jìn)而可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視。陳建鋒等[11]認(rèn)為細(xì)胞死亡的不同方式對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答可能有著不同的影響，如細(xì)胞的凋亡可能抑制局部的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受，而細(xì)胞的壞死則啟動(dòng)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)，加強(qiáng)免疫應(yīng)答。

本研究分別采用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)、CCK-8方法檢測(cè)凋亡大腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)的免疫細(xì)胞活性及增殖情況，結(jié)果顯示，與壞死細(xì)胞組及腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，凋亡腫瘤細(xì)胞組中不同效靶比的CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性及A450值均降低(P<0.05)，這提示與凋亡大腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)的免疫細(xì)胞活性及增殖受到抑制。因此，可以初步認(rèn)為不僅是正常細(xì)胞凋亡可以抑制機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，凋亡的大腸癌CT26細(xì)胞也可抑制T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖和活性，這意味著凋亡腫瘤細(xì)胞也可以像正常細(xì)胞凋亡時(shí)那樣誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫耐受。多年來(lái)一直認(rèn)為這些凋亡細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的影響極小，而腫瘤細(xì)胞往往會(huì)抑制細(xì)胞凋亡特別是對(duì)腫瘤細(xì)胞自身的凋亡刺激[12]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)通過吞噬負(fù)載抗原的凋亡細(xì)胞而誘導(dǎo)了免疫耐受，未成熟的DC細(xì)胞能遞呈凋亡信號(hào)至抗原特異性T細(xì)胞，從而抑制了T細(xì)胞的增殖，這表明在體內(nèi)凋亡的誘導(dǎo)能導(dǎo)致抗原特異性耐受，很有可能通過DC和Treg介導(dǎo)[13]。凋亡細(xì)胞導(dǎo)致免疫耐受已在一些器官移植的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[14-15]。此外，陳建峰等[11]以大鼠心臟移植作為動(dòng)物模型，將紫外線照射后培養(yǎng)8 h的供者凋亡脾細(xì)胞注入受鼠體內(nèi)，分別在輸注后0、3、7、14 d將供鼠心臟移植至受鼠腹腔內(nèi)，結(jié)果提示紫外線能有效誘導(dǎo)大鼠脾細(xì)胞凋亡，預(yù)輸注供者凋亡脾細(xì)胞組移植心臟存活期明顯延長(zhǎng)，而輸注相同活細(xì)胞或死細(xì)胞組則無(wú)此效應(yīng)，表明凋亡細(xì)胞能主動(dòng)抑制受者淋巴細(xì)胞活性，延長(zhǎng)同種移植物存活時(shí)間。Sun[16]將人白血病細(xì)胞株K560和HL-60用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑芬戈莫德和放線菌酮誘導(dǎo)凋亡后，與小鼠脾源性淋巴細(xì)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能抑制CD3+小鼠T淋巴細(xì)胞的早期活化因子CD69的表達(dá)，表明凋亡腫瘤細(xì)胞在抑制T細(xì)胞的活化、調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫方面起重要的作用。而我們也發(fā)現(xiàn)凋亡大腸癌CT26細(xì)胞可抑制T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖和活性。這提示當(dāng)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)功能受到抑制時(shí)，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。但也有學(xué)者報(bào)告凋亡細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)有相反的作用，Wang等[17]從C57/B1/6小鼠脾分離的活化T細(xì)胞，并用30 Gy的放射線照射以使T細(xì)胞凋亡，然后將凋亡T細(xì)胞注射同基因小鼠腹腔，結(jié)果顯示免疫小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞和CD62L+T細(xì)胞的比例明顯增多，對(duì)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。

然而，目前仍未完全明確細(xì)胞凋亡是如何對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。既往學(xué)者認(rèn)為Fas及其配體可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是它們?cè)谘装Y反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)方面的作用尚未明確[18]。而目前的觀點(diǎn)認(rèn)為已凋亡細(xì)胞提供了豐富的抗原，從而使機(jī)體建立起外周免疫耐受[19]。Dupont等[20]在總結(jié)前人的基礎(chǔ)上提出，F(xiàn)as配體之所以在免疫赦免中扮演重要角色，是因?yàn)橛蒄as配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)等腫瘤壞死因子家族通過誘導(dǎo)浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制免疫應(yīng)答的目的；其對(duì)比經(jīng)鼠源Fas配體(mouse Fas ligand，mFasL)和可溶性Fas配體(soluble Fas ligand，sFasL)激活的T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在體外暴露于細(xì)胞表面的mFasL高度表達(dá)于DAP-3小鼠的成纖維細(xì)胞并激活T淋巴細(xì)胞的凋亡，而sFasL是一種較低效的T淋巴細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，可是通過分子交聯(lián)可以大大提升sFasL的效率；同時(shí)發(fā)現(xiàn)雖然sFasL在激活T淋巴細(xì)胞的凋亡方面相當(dāng)?shù)托?，可是卻可以強(qiáng)力促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化。少量的研究表明缺乏sFasL可能導(dǎo)致無(wú)法激活中性粒細(xì)胞招募[21]。然而目前sFasL誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞招募現(xiàn)象的機(jī)制尚不明確。Lloyd等[22]認(rèn)為經(jīng)Fas介導(dǎo)的凋亡可能不是一個(gè)被動(dòng)的過程，而是凋亡細(xì)胞主動(dòng)釋放高水平的細(xì)胞因子IL-1和IL-10。Miwa等[23]則認(rèn)為FasL引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的進(jìn)一步機(jī)制是FasL可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β。而目前被廣泛接受的機(jī)制則是由Chen等[24]提出的，其認(rèn)為FasL誘導(dǎo)了可以產(chǎn)生激活中性粒細(xì)胞增殖作用的蛋白激酶。本研究針對(duì)sFas的表達(dá)水平及相關(guān)免疫因子的水平進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細(xì)胞組sFas相對(duì)表達(dá)量低于壞死腫瘤細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，且凋亡腫瘤細(xì)胞組抗炎因子IL-4表達(dá)水平高于腫瘤細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，抗炎因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平則高于其他兩組(P<0.05)，促炎因子IL-12表達(dá)水平低于其他兩組(P<0.05)。這提示相對(duì)于正常生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞及已經(jīng)發(fā)生死亡的腫瘤細(xì)胞，凋亡中或者即將啟動(dòng)凋亡的腫瘤細(xì)胞中sFas及相關(guān)抗炎免疫因子表達(dá)水平上升。這從另一角度反映炎癥反應(yīng)得到抑制，同時(shí)也提示即使Fas配體能夠抑制細(xì)胞凋亡，但在已經(jīng)發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞中卻能發(fā)揮抑制T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性甚至低效誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，在此基礎(chǔ)上可能聯(lián)合產(chǎn)生誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化，進(jìn)而達(dá)到產(chǎn)生機(jī)體免疫耐受。所以當(dāng)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)功能受到抑制時(shí)，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，凋亡小鼠大腸癌CT26細(xì)胞能夠抑制小鼠特異性CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖及其活性，影響了大腸癌小鼠正常免疫功能。凋亡大腸癌CT26細(xì)胞sFas表達(dá)降低影響其自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的部分炎癥因子及其活性，緩解局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制小鼠免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫抑制或免疫耐受。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)于凋亡CT26細(xì)胞抑制小鼠特異性CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖及其活性的具體機(jī)制沒有展開具體研究，實(shí)驗(yàn)中部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能是樣本數(shù)不足、重復(fù)性不夠、測(cè)量誤差等原因引起，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

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Effects of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on serum levels of immunological factors,proliferation and activity of immunological cells in mice

SUNChao-wen,ZHANGGuang-yu,ZHAOChen,CHENGHuai-fu,ZHONGLi,DAILing

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effects of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on the serum immunological factors levels,the proliferation and activity of immunological cells in mice.Methods Colorectal cancer CT26 cells during logarithmic growth phase were used to prepare the apoptotic and necrotic tumor cells.T lymphocyte subsets and natural killer(NK) cells were isolated and macrophages were obtained from 20 Balb/c mice,and then cytotoxic T lymphocytes(CTL) were prepared.CTL,NK cells and macrophages were divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group after treated with corresponding tumor cells.51Cr release assay was used to detect the activities of CTL,NK cells and macrophages in each group.Cell counting kit-8(CCK-8) assay was used to detect the proliferation of CTL,NK cells and macrophages.Another Balb/c mice were selected and divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,with 10 rats in each group.Apoptotic CT26 cells,necrotic CT26 cells and CT26 cells during logarithmic growth phase were subcutaneously and intravenously infused into mice in corresponding groups.The enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the expression levels of serum soluble Fas(sFas),interference gamma(IFN-γ),interleukin(IL)-4,IL-10,IL-12 and transforming growth factor-β(TGF-β).Results Compared to the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group,the activities of CTL,NK cells and macrophages with different effect-or-target ratios decreased in the apoptotic tumor cell group(P<0.05).The results of CCK-8 assay showed that theA450 values of CTL,NK cells and macrophages in the apoptotic tumor cell group were lower than those in either the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group(P<0.05).ELISA assay showed that the relative expression of sFas in the apoptotic tumor cell group was lower than that in either the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group(P<0.05).Expression level of IL-4 in the apoptotic tumor cell group was higher than that in the tumor cell control group(P<0.05).Expression levels of IL-10 and TGF-β were higher and expression level of IL-12 was lower in the apoptotic tumor cell group compared to the other two groups(P<0.05).Conclusion Apoptotic colorectal cancer CT26 cells can inhibit the proliferation and activities of specific CTL,NK cells and macrophages in mice,and affect the normal immune function of mice with colorectal cancer. 【Key words】 Colorectal cancer,CT26 cells,Cytotoxic T lymphocyte,Nature killer cell,Macrophages,Soluble Fas

廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA276035)；廣西桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃(20120121-1-13)

孫朝文(1988～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科。

張廣鈺(1966～)， 男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科，E-mail：acrosssky@126.com。

R 735.3

A

0253-4304(2016)10-1337-06

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.01

2016-05-20

2016-07-22)