黃秀榮 張群先 劉愛菊 陸 爽 梁慧娜 黃麗月

(廣西河池市人民醫(yī)院檢驗科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

臨床創(chuàng)新

支原體固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)在支原體感染診斷中的應(yīng)用效果比較▲

黃秀榮 張群先 劉愛菊 陸 爽 梁慧娜 黃麗月

(廣西河池市人民醫(yī)院檢驗科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

目的 比較固體培養(yǎng)及液體培養(yǎng)在支原體感染診斷中的應(yīng)用效果。方法 采用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基平行檢測628例泌尿生殖道標(biāo)本的支原體感染情況，比較兩種方法的檢出陽性率及污染率，對液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性、液體培養(yǎng)陰性而因體培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行分析。結(jié)果 固體培養(yǎng)法的檢出陽性率為45.86%(288/628)，液體培養(yǎng)法的為49.36%(310/628)。固體培養(yǎng)法的污染率為1.91%，低于液體培養(yǎng)法的8.44%(P<0.05)。液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性共42例，經(jīng)液體培養(yǎng)傳代后取其紅色培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體培養(yǎng)基上再次培養(yǎng)，有13例(2.07%)長出支原體典型菌落，且原固體培養(yǎng)經(jīng)延長培養(yǎng)時間(延長24 h)后也出現(xiàn)少數(shù)支原體典型菌落。液體培養(yǎng)陰性而固體培養(yǎng)陽性共20例(3.18%)，取其液體培養(yǎng)的紅色渾濁培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體平板培養(yǎng)再次培養(yǎng)，可見有支原體生長。結(jié)論 液體培養(yǎng)污染率大、易誤診，但可快速檢測藥敏結(jié)果；固體培養(yǎng)污染率低，且能直接觀察到支原體屬特有的典型菌落，兩者結(jié)合診斷對指導(dǎo)臨床治療具有較好的臨床應(yīng)用價值。

支原體感染；固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)

支原體是一種最小的原核細(xì)胞型微生物，能夠在無生命的培養(yǎng)基上繁殖生長，其種類繁多、分布廣泛，具有很強(qiáng)的傳染性，主要感染泌尿生殖系統(tǒng)，嚴(yán)重影響人們的身心健康，甚至導(dǎo)致不育不孕等，降低人們的生活質(zhì)量。支原體感染前期患者無癥狀或癥狀不明顯，因此未能得到及時診斷、治療。目前我國實驗室檢測支原體常用的方法是液體培養(yǎng)法，該方法方便、快捷、靈敏度高，但液體培養(yǎng)法只是通過添加不同底物進(jìn)行生化反應(yīng)而間接判斷結(jié)果，存在假陽性，且存在較為嚴(yán)重的污染問題。固體培養(yǎng)法能夠準(zhǔn)確觀察支原體的菌落形態(tài)，有一定的優(yōu)越性。本研究采用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基對628份泌尿生殖道標(biāo)本進(jìn)行平行檢測，分析其檢出陽性率、污染率等，為臨床提供診斷參考依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2014年4～8月我院婦科、皮膚性病科、泌尿外科收集的泌尿生殖道標(biāo)本628份，其中女性332例，年齡11～54歲，男性296例，年齡18～62歲。均采用無菌拭子取尿道分泌物或?qū)m頸分泌物，同一患者均取雙份標(biāo)本，采集后及時送檢。

1.2 試劑與儀器 所用的液體培養(yǎng)基為解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，Uu)和人型支原體(Mycoplasmahominis，Mh)分離、鑒定、藥敏試劑盒(由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；批號：20140122)；固體培養(yǎng)基為Uu和Mh的選擇性培養(yǎng)基(由江門市凱林貿(mào)易有限公司提供；批號：140311)。儀器選用普通的光學(xué)顯微鏡(BX43奧林巴斯)和上海比朗智能生化培養(yǎng)箱、常州冠軍CHP-160二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 培養(yǎng)方法 標(biāo)本一般在收集后2 h內(nèi)接種。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：將其中一份標(biāo)本拭子直接滾動涂劃在固體培養(yǎng)基上，編號后放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)：將另一份拭子標(biāo)本置入液體培養(yǎng)基內(nèi)反復(fù)攪拌并在瓶壁內(nèi)擠壓，盡量把全部樣本都洗于培養(yǎng)液中，丟棄棉拭子，然后取100 μl混合液置入檢測板各孔中，滴加礦物油覆蓋，然后將檢測板條放入生化培養(yǎng)箱，35～37℃條件下孵育。

1.4 結(jié)果觀察與判定 (1)固體培養(yǎng)：培養(yǎng)48 h后(若陰性則延長到60 h后觀察)在低倍鏡下觀察固體瓊脂平板上是否有支原體屬特征性菌落生長。若見到典型棕褐色海膽樣支原體菌落(菌落中有沙粒狀物質(zhì)，直徑10～50 μm)為Uu陽性，若見到煎蛋樣支原體菌落(直徑100～300 μm)為Mh培養(yǎng)陽性，若同時見到上述兩種菌落則為Uu、Mh混合陽性，若無典型菌落生長，則為陰性。(2)液體培養(yǎng)：培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。培養(yǎng)液由黃色變?yōu)榧t色且澄清者判定為陽性，無顏色變化或顏色變紅但出現(xiàn)明顯混濁或沉淀者判定為陰性。(3)污染判定：固體瓊脂平板上有雜菌生長并影響結(jié)果觀察則判為固體培養(yǎng)污染；液體培養(yǎng)液變紅但出現(xiàn)明顯渾濁或沉淀的則判為液體培養(yǎng)污染。

2 結(jié) 果

2.1 固、液體培養(yǎng)結(jié)果及檢出陽性率的比較 628例泌尿生殖道標(biāo)本，固體培養(yǎng)陽性288例(45.86%)，陰性340例(54.14%)，其中固體培養(yǎng)有12例雜菌生長嚴(yán)重影響結(jié)果觀察而判定為陰性；液體培養(yǎng)陽性310例(49.36%)，陰性318例(50.64%)，53例培養(yǎng)液為紅色渾濁而判定為陰性。

2.2 固、液體培養(yǎng)法污染率的比較 固體培養(yǎng)有12例雜菌生長嚴(yán)重影響結(jié)果判斷，污染率為1.91%；液體培養(yǎng)有53例培養(yǎng)液紅色渾濁，污染率為8.44%，液體培養(yǎng)污染率高于固體培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.27，P<0.05)。

2.3 液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性、液體培養(yǎng)陰性而固體培養(yǎng)陽性的標(biāo)本二次固體培養(yǎng)結(jié)果 固、液體培養(yǎng)同時為陽性268例，同時為陰性298例。液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性共42例。將42例經(jīng)液體培養(yǎng)傳代后取其紅色培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體培養(yǎng)基上再次培養(yǎng)，有13例(2.07%)長出支原體典型菌落，且原固體培養(yǎng)經(jīng)延長培養(yǎng)時間(延長24 h)后也出現(xiàn)少數(shù)支原體典型菌落；其余29例，經(jīng)液體培養(yǎng)傳代后取其紅色培養(yǎng)液二次固體培養(yǎng)和延長原固體培養(yǎng)時間(延長24 h)均無支原體菌落生長。

液體培養(yǎng)陰性而固體培養(yǎng)陽性共20例，均為液體培養(yǎng)后的培養(yǎng)液為紅色渾濁而判定為陰性，而在原固體培養(yǎng)可見到支原體典型菌落。這20例(3.18%)取其液體培養(yǎng)的紅色渾濁培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體平板再次培養(yǎng)，可見有支原體生長。其余液體培養(yǎng)時培養(yǎng)液為紅色渾濁而判定為陰性的33例，原固體培養(yǎng)無支原體生長，取其紅色渾濁培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體平板培養(yǎng)也無支原體生長。

3 討 論

本研究對628例泌尿生殖道標(biāo)本分別采用液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)法檢測支原體，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)檢出率為49.36%(310/628)，固體培養(yǎng)法檢出率為45.86%(288/628)，與陳紅霞等[1]報告相似。目前我國使用的支原體液體培養(yǎng)試劑是商品化試劑盒，操作十分簡便，是利用培養(yǎng)與生化反應(yīng)相結(jié)合的原理進(jìn)行支原體培養(yǎng)、鑒定、計數(shù)和藥敏測定。Uu具有脲酶，能分解尿素產(chǎn)生氨或胺，Mh具有精氨酸脫羧酶分解精氨酸也產(chǎn)生氨氣，均可使培養(yǎng)液的pH升高，指示劑變紅色，加上支原體個體微小，生長繁殖后也不會使培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁或生成沉淀，因此以培養(yǎng)48 h內(nèi)液體變紅且澄清者判定為陽性。但這種生化反應(yīng)特異性較差，不是支原體所特有，極少量堿性標(biāo)本也可會直接導(dǎo)致培養(yǎng)液變紅，從而出現(xiàn)假陽性；此外盡管培養(yǎng)液有多種抗生素可抑制雜菌生長，但由于臨床上抗生素濫用，有可能導(dǎo)致檢測標(biāo)本中含有少數(shù)有分解尿素或精氨酸能力的耐藥菌株，從而引起假陽性反應(yīng)。本研究中，有29例初次液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性，但經(jīng)液體培養(yǎng)傳代后二次固體培養(yǎng)和延長原固體培養(yǎng)時間均無支原體菌落生長，如根據(jù)首次液體培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行診斷，可導(dǎo)致誤診。同時，液體培養(yǎng)陰性而固體培養(yǎng)陽性共20例(3.18%)，而取其液體培養(yǎng)的紅色渾濁培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種到固體平板再次培養(yǎng)均可見有支原體生長，這一比例低于周良佳[2]報告的結(jié)果，可能和標(biāo)本類型、所用試劑廠家不同有關(guān)。液體培養(yǎng)時可因培養(yǎng)液變紅色并出現(xiàn)渾濁可導(dǎo)致假陰性，而培養(yǎng)液變紅色且渾濁的原因有：(1)細(xì)菌或真菌污染標(biāo)本引起渾濁，同時伴有支原體生長；(2)標(biāo)本的上皮細(xì)胞、白細(xì)胞或黏液過多引起渾濁，同時有支原體生長[3]；(3)無支原體生長，具有分解尿素或精氨酸能力的細(xì)菌、真菌污染引起。由此可見，僅憑顏色變化和是否渾濁來判定液體培養(yǎng)的結(jié)果會導(dǎo)致假陽性和假陰性，也無法判斷那些紅色渾濁標(biāo)本是否有支原體生長，從而造成漏檢[4]。因此，在對渾濁培養(yǎng)液進(jìn)行判斷時，應(yīng)該加用固體培養(yǎng)基進(jìn)行確認(rèn)。

含有支原體生長營養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基，抑菌能力較強(qiáng)[5]，特異性好，與液體培養(yǎng)相比其有很大優(yōu)勢：(1)首先培養(yǎng)24～48 h后固體培養(yǎng)基上長出低倍鏡下可以觀察的典型的支原體菌落，不會出現(xiàn)假陽性，結(jié)果可靠；(2)其次在固體瓊脂平板上可以同時鑒別不同的支原體，有利于支原體的分類和純化。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24 h后固體培養(yǎng)基上就可見到Uu和Mh菌落，48 h后菌落形態(tài)更加典型，Uu呈典型海膽樣菌落(10 ～50 μm)或不典型微小型、空泡型支原體樣菌落[6]，Mh呈油煎蛋樣菌落(100～300 μm)；再者固體培養(yǎng)基上少有其他雜菌生長，即使有少量生長也不影響支原體的生長和觀察[7]。本研究中，有37例在固體培養(yǎng)基上有雜菌生長，但其中25例雜菌菌落少，不影響支原體生長和觀察，只有12例長滿雜菌影響結(jié)果觀察而判為陰性，污染率為1.91%，與潘新娣等[8]報告相似，且污染率明顯低于液體培養(yǎng)(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，液體培養(yǎng)陽性而固體培養(yǎng)陰性的42例標(biāo)本中，有13例經(jīng)液體培養(yǎng)傳代后固體培養(yǎng)長出支原體典型菌落，而原固體培養(yǎng)經(jīng)延長培養(yǎng)時間(約24 h)也出現(xiàn)少數(shù)支原體典型菌落。其原因可能是原標(biāo)本含支原體量太少，直接接種到固體瓊脂平板上的菌落極少，在顯微鏡下不易發(fā)現(xiàn)，或是固體瓊脂平板放置過久，瓊脂水分蒸發(fā)，支原體難于生長。因此，當(dāng)液體培養(yǎng)出現(xiàn)陽性而固體培養(yǎng)陰性時最好延長固體培養(yǎng)時間，以免漏檢。

綜上所述，液體培養(yǎng)僅靠顏色、清濁度來判讀結(jié)果，主觀性強(qiáng)，無法確認(rèn)支原體是否存在，臨床實驗中由于標(biāo)本易污染常出現(xiàn)誤診或漏診，但該方法操作簡便、快捷，又附帶藥敏結(jié)果，可作為支原體檢測的初篩試驗；固體培養(yǎng)可直接觀察到支原體特有典型菌落而確證支原體的存在，其污染率小，不易漏診，可作為支原體檢測的確認(rèn)試驗；兩種方法聯(lián)合使用具有快速、準(zhǔn)確的檢測效果，且具有培養(yǎng)與藥敏同時進(jìn)行的特點，可提高支原體感染診斷的準(zhǔn)確性，從而提高治療療效，特別是針對癥狀明顯、療效不佳、反復(fù)發(fā)作的患者。

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[2] 周良佳,連大帥,許 鍇,等.現(xiàn)有液體培養(yǎng)法檢測解脲脲原體效果的評價[J].中國人獸共患病學(xué)報,2015,31(1):16-20.

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廣西河池市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃(河科推1430-4)

黃秀榮(1972～)，女，碩士研究生，副主任技師，研究方向：微生物檢驗。

R 518.9

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0253-4304(2016)10-1455-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.34

2016-04-20

2016-07-01)