張亞宏，甘 瑩，齊建國(guó)，王建紅

（河南大學(xué)，天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)封475004）

米托蒽醌通過(guò)活性氧誘導(dǎo)大鼠肝癌RH35細(xì)胞凋亡的研究

張亞宏，甘 瑩，齊建國(guó)＊，王建紅＊

（河南大學(xué)，天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)封475004）

摘 要：試驗(yàn)旨在探討米托蒽醌（mitoxantrone，MTN）對(duì)大鼠肝癌RH35細(xì)胞毒性及其作用機(jī)制。以MTT法檢測(cè)MTN的細(xì)胞毒性，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，MTN時(shí)間和劑量依賴性地抑制RH35細(xì)胞的生長(zhǎng)；15μmol／L MTN作用于細(xì)胞24、48h后可使細(xì)胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體，且其可時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞比率的增加及ROS的產(chǎn)生；ROS清除劑NAC可以極顯著降低MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞的ROS的產(chǎn)生和凋亡率（P＜0.01）；15mmol／L NAC可以下調(diào)MTN誘導(dǎo)的caspase－3、Bax及CytC表達(dá)增加，上調(diào)MTN誘導(dǎo)的Bcl－2表達(dá)降低。結(jié)果提示，MTN通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS而誘導(dǎo)RH35細(xì)胞發(fā)生凋亡。

關(guān)鍵詞：米托蒽醌；凋亡；RH35細(xì)胞；活性氧

肝癌是中國(guó)僅次于胃癌、食道癌的第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，其惡性程度高，發(fā)展迅速，早期癥狀不明顯，往往造成根治性手術(shù)治療困難［1－2］。藥物治療仍是目前肝癌治療的重要方法，但是肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物具有不敏感性［3］，因此，闡明藥物的抗肝癌機(jī)制對(duì)肝癌的治療至關(guān)重要。米托蒽醌（mitoxantrone，MTN）是蒽醌類細(xì)胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物，心臟毒性較小，臨床上主要用于治療惡性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病，對(duì)肺癌、黑色素瘤、卵巢癌等也有一定的療效［4－5］。臨床研究表明，MTN對(duì)肝癌具有良好的療效，但是其具體機(jī)制還不甚明了［6－7］。凋亡是很多化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的有效機(jī)制［8］，研究表明，MTN可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。齊美穎等［9］發(fā)現(xiàn)MTN可以激活內(nèi)、外源性凋亡通路誘導(dǎo)人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226凋亡；王煒等［10］闡明MTN通過(guò)抑制PI3K／Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE－2細(xì)胞發(fā)生凋亡；魏建勛等［11］發(fā)現(xiàn)MTN通過(guò)抑制Mcl－1再抑制人卵巢癌COC1細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡；Kostrzewa－Nowak等［12］發(fā)現(xiàn)MTN可以誘導(dǎo)人白血病HL60細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞HL60／DOX發(fā)生凋亡。本研究選用大鼠肝癌RH35細(xì)胞為研究對(duì)象，研究MTN對(duì)該腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用并探討其機(jī)制，為其在抗肝癌中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

大鼠肝癌RH35細(xì)胞系購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。MTN購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲基噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、N－乙酰半胱氨酸（N－acetylcysteine，NAC）和2，7－二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCF－DA）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；caspase－3、Bax、Bcl－2、CytC及β－actin的單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自北京元亨圣馬生物試劑公司；Annexin V－FITC／PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠肝癌RH35細(xì)胞單層接種在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RH35細(xì)胞，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（1、5、10、30、50μmol／L）的MTN。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24及48h后，每孔加入MTT（5g／L）10μL再培養(yǎng)3h后，棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶解，于酶標(biāo)儀下測(cè)定各孔吸光值（A492nm值），根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率（%）＝［A492nm（陰性）－A492nm（給藥）］／［A492nm（陰性）－A492nm（空白）］×100%

1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RH35細(xì)胞，以每孔5.0×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后加入15μmol／L MTN，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)活性氧

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RH35細(xì)胞，以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞分瓶，培養(yǎng)24h后，加入15μmol／L MTN，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36及48h；或加入5mmol／L NAC作用1h后加入15μmol／L MTN，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用PBS清洗1次，根據(jù)Annexin V－FITC／PI染色試劑盒說(shuō)明操作后，流式細(xì)胞儀分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率；或加入5μmol／L DCF－DA染液，37℃孵育30min，于激發(fā)波長(zhǎng)513nm、發(fā)射波長(zhǎng)530nm下用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。

1.6Western blotting分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RH35細(xì)胞，以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞分瓶，培養(yǎng)24h后，加入5mmol／L NAC作用1h后加入15μmol／L MTN，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用100μL細(xì)胞裂解液冰浴裂解1h，15 000r／min離心5min，收集上清。加入5×上樣緩沖液，沸水中煮沸3min，使蛋白質(zhì)變性。Bio－Rad法進(jìn)行蛋白定量后以12%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，一抗封閉過(guò)夜，再以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液封閉2h，以二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，掃描記錄。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 13.0軟件中的One－Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1MTN對(duì)RH35細(xì)胞的細(xì)胞毒性

MTN可時(shí)間和劑量依賴性地抑制RH35細(xì)胞生長(zhǎng)。由圖1可知，1～50μmol／L MTN對(duì)RH35細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，且隨著MTN濃度增強(qiáng)，作用時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)RH35的毒性也在增強(qiáng)。其在12、24和48h的IC50值分別為22.46、14.92和10.1μmol／L。在24h時(shí)，15μmol／L MTN可誘導(dǎo)明顯的生長(zhǎng)抑制，因此，選用其為以下研究的濃度。

圖1　MTN對(duì)RH35細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.1 Cytotoxic effects of MTN on RH35cells

2.2MTN誘導(dǎo)RH35細(xì)胞凋亡

顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞連接緊密，無(wú)死亡細(xì)胞（圖2A），而15μmol／L MTN作用于細(xì)胞24、48h后，細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體（圖2B、2C）。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，15μmol／L MTN作用于細(xì)胞12、24、36及48h后，凋亡細(xì)胞比率（早期凋亡細(xì)胞＋晚期凋亡細(xì)胞）呈時(shí)間依賴性增加，表明MTN可以時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)RH35細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖3）。

圖2　MTN誘導(dǎo)RH35細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（200×）Fig.2 MTN induced morphologic changes in RH35cells（200×）

圖3　MTN時(shí)間依賴性誘導(dǎo)RH35細(xì)胞凋亡Fig.3 MTN time－dependently induced apoptosis in RH35cells

2.3MTN誘導(dǎo)RH35細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

由圖4可知，15μmol／L MTN作用于細(xì)胞0h細(xì)胞ROS水平為1.53%，而作用12、24、36及48h后ROS水平分別為16.69%、25.25%、38.03%、48.17%。結(jié)果表明，MTN可時(shí)間依賴性的增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

圖4　MTN時(shí)間依賴性誘導(dǎo)RH35細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生Fig.4 MTN time－dependently induced intracellular ROS generation in RH35cells

2.4NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

由圖5可知，NAC為ROS清除劑，加入5mmol／L NAC后，15μmol／L MTN作用細(xì)胞24h ROS水平由26.57%下降為10.60%，表明NAC可以極顯著降低ROS的水平（P＜0.01）。

圖5　NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.5 Effect of NAC on MTN－induced ROS in RH35cells

2.5NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞凋亡的影響

由圖6可知，15μmol／L MTN作用細(xì)胞24h凋亡率為33.56%，加入NAC后，其細(xì)胞凋亡率降為17.10%，表明NAC可以極顯著降低MTN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

2.6NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖7可知，15μmol／L MTN作用細(xì)胞24h后，caspase－3前體表達(dá)下降而活性形式表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax及CytC表達(dá)增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下降；加入NAC后，可以明顯逆轉(zhuǎn)上述蛋白的變化，即MTN誘導(dǎo)的caspase－3的活化明顯下調(diào)，促凋亡蛋白Bax的增加及抑凋亡蛋白Bcl－2的下降均被抑制，進(jìn)一步表明NAC可以抑制MTN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖6　NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of NAC on MTN－induced apoptosis in RH35cells

圖7　NAC對(duì)MTN誘導(dǎo)的RH35細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of NAC on MTN－induced expressions of apoptosis related proteins in RH35cells

3 討 論

蒽環(huán)類藥物是最有效的抗腫瘤藥物，臨床上常用的阿霉素、多柔比星、MTN均是以蒽環(huán)結(jié)構(gòu)為母環(huán)的，具有良好的療效。臨床研究表明，MTN對(duì)肝癌具有良好的療效［6－7］，但是其作用機(jī)制尚不明確，研究其抗肝癌機(jī)制，有利于該類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，為開(kāi)發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)，并有利于指導(dǎo)MTN的臨床用藥。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是在特定基因調(diào)控下細(xì)胞主動(dòng)的死亡過(guò)程，其受細(xì)胞內(nèi)外多種信號(hào)刺激的調(diào)控，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制［13－14］。MTN時(shí)間、劑量依賴性地抑制RH35細(xì)胞生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下觀察到其可以使細(xì)胞浮起、變圓，并出芽形成凋亡小體。Annexin V－FITC／PI雙染陽(yáng)性細(xì)胞與Annexin V－FITC陽(yáng)性細(xì)胞相加所成的細(xì)胞凋亡率也隨著MTN加入時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提示MTN誘導(dǎo)RH35細(xì)胞發(fā)生了凋亡。細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，很多蛋白家族參與了凋亡的調(diào)控，其中caspase家族為一類與凋亡密切相關(guān)的酶類，其在凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，而caspase－3則被認(rèn)為是凋亡的標(biāo)志之一［15－16］；Bcl－2家族蛋白及CytC是線粒體途徑凋亡的重要參與因子，Bcl－2家族促／抗凋亡蛋白的平衡決定著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程［17］。加入MTN后，caspase－3被激活而其前體procaspase－3表達(dá)量減少。MTN可以誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下降，并可以促進(jìn)CytC的釋放。這些凋亡相關(guān)蛋白的變化進(jìn)一步證明MTN誘導(dǎo)RH35細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

ROS在細(xì)胞的各種生命進(jìn)程中都發(fā)揮著重要的作用，其可作為第二信使調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［18－20］。研究表明，蒽環(huán)類藥物阿霉素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的主要機(jī)制是誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而損壞線粒體而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［21］。Xie等［22］發(fā)現(xiàn)黃連素可以通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生調(diào)節(jié)Bcl－2家族促／抗凋亡蛋白的比率進(jìn)而誘導(dǎo)人乳腺癌MCF－7及MDA－MB－231細(xì)胞凋亡。此外，Arnold等［23］亦證實(shí)MTN可以通過(guò)增加ROS的水平誘導(dǎo)人紅細(xì)胞程序性死亡（eryptosis，紅細(xì)胞凋亡）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTN可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，清除了ROS后，MTN所引起的凋亡被抑制，而由MTN引起的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化均被逆轉(zhuǎn)，證明ROS在MTN誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮著重要的作用，其介導(dǎo)了MTN誘導(dǎo)的凋亡，即MTN通過(guò)誘導(dǎo)RH35細(xì)胞ROS的產(chǎn)生而誘導(dǎo)凋亡。而在此過(guò)程中MTN如何誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與凋亡的調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，MTN對(duì)大鼠RH35細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其是通過(guò)誘導(dǎo)RH35細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號(hào)：Q813.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3245－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.024

收稿日期：2016－08－26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（U1404819）；河南省自然科學(xué)基金（132300410228）

作者簡(jiǎn)介：張亞宏（1982－），女，山東濟(jì)寧人，博士，副教授，研究方向：毒理學(xué)與腫瘤藥理學(xué)，E－mail：zhangyahong＿131＠163.com

通信作者：＊齊建國(guó)（1985－），男，遼寧沈陽(yáng)人，博士，副教授，研究方向：毒理學(xué)與藥物化學(xué)，E－mail：qijianguo＠henu.edu.cn王建紅（1971－），男，河南許昌人，博士，教授，研究方向：毒理學(xué)與藥物化學(xué)，E－mail：jhworg＠126.com

Mitoxantrone Induced Apoptosis through ROS in Rat Hepatama RH35Cell Line

ZHANG Ya－h(huán)ong，GAN Ying，QI Jian－guo＊，WANG Jian－h(huán)ong＊
（KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmuno－engineering，HenanUniversity，Kaifeng475004，China）

Abstract：The assay was aimed to study the cytotoxicity and mechanisms of mitoxantrone（MTN）in rat hepatama cell line RH35.MTT assay was performed to assess the cytotoxicity of MTN，and microscope was used to observe cellular morphologic changes.Apoptotic ratio and intracellular ROS generation were measured by flow cytometric analysis.The protein expression was examined by Western blotting analysis.The results showed that MTN inhibited RH35cell growth in a timeand concentration－dependent manner.The morphologic changes were observed in the cells，including cell shrinkage，membrane blebbing and apoptotic bodies when treated with 15μmol／L MTN for 24and 48h.And MTN also induced the increase of apoptotic ratio and generation of ROS in a time dependent manner.In addition，the intracellular ROS generation ratio and the apoptotic ratio of MTN treated group were extremely decreased by the ROS scavenger NAC（P＜0.01）.The pretreatment of RH35cells with 15mmol／L NAC thoroughly reversed the MTN－induced enhancement of caspase－3，Bax and CytC level and attenuation of Bcl－2level.In conclusion，MTN induced apoptosis in RH35cells through increasing the generation of ROS.

Key words：mitoxantrone；apoptosis；RH35cell；ROS